目前,在畜牧领域,有关VD3的研究主要集中在其与肌肉、骨骼健康生长发育的内在关系[1],聚焦VD3作为微量营养素的生物学功能研究。但是,越来越多研究发现,活性VD3也积极参与免疫调节与抗氧化功能的过程[2]。25-羟维生素D3(25-(OH)-D3)是VD3代谢的中间产物,在调节炎症、消灭入侵微生物和寄生虫、减少日常暴露于有毒物质后的氧化应激等方面至关重要,血液中25-(OH)-D3的浓度反映VD3的摄入量[3]。维生素D3受体(VDR)是1种核受体,介导VD3活性代谢物1α,25-二羟维生素D3(1α,25-(OH)2-D3)的大多数已知功能,影响从钙代谢到抗菌肽的表达等过程[4]。随着研究的深入,VD3在畜禽领域的应用也逐渐展露。1维生素D的来源、代谢以及反馈调节机制维生素D(VD)是类固醇激素。VD主要以两种形式存在[5]。VD3主要在动物皮肤中产生;维生素D2(VD2)不同于VD3,由植物产生的C24中的甲基基团和C22-C23中的双键组成[6]。VD3可以在动物源食物中摄取,或由皮肤中7-脱氢胆固醇经紫外线照射转化而成,经血入肝后,在含细胞色素P450氧化酶(CYP450)的线粒体内经25-羟化酶(CYP2R1)催化下发生25-羟基化,生成25-(OH)-D3。25-(OH)-D3与肝脏实质细胞合成的VD3结合蛋白结合并转移入肾,被近端小管上皮细胞的线粒体中的1α-羟化酶(CYP27B1)催化转化成有活性的1α,25-(OH)2-D3[7]。动物体内主要通过1α,25-(OH)2-D3发挥生理功能[8]。此外,还有其他代谢途径对VD3发挥功能至关重要,这些途径包括C3差向异构化、CYP24A1羟化酶和CYP11A1替代代谢[9]。使用VD3时需要注意其副作用,如高钙血症和血管钙化[10]。机体内的VD3、Klotho、成纤维细胞生长因子23(FGF23)以及甲状旁腺激素(PTH)构成维持机体正常钙磷代谢稳态的系统[11]。这一系统失调会打破钙磷代谢稳态,对机体造成损伤甚至引发死亡。在低血钙时,VD3与VDR作用会促进肠道和肾脏对磷酸盐的重吸收,造成高磷血症,但通过VD3刺激VDR上调骨骼中FGF23的产生和肾脏中的Klotho产生,可以确保排出过量的磷酸盐,防止高磷血症和与衰老相关问题的发生(如异位钙化)[12]。FGF23可以抑制磷酸钠协同转运蛋白Npt2a和Npt2c的表达,抑制近端肾小管中的磷酸盐重吸收[13]。此外,FGF23抑制1α-水解酶的表达,导致1α,25-(OH)2-D3的形成减少。FGF23还可以抑制肾脏的α-Klotho基因转录和甲状旁腺中PTH的产生[14]。1α,25-(OH)2-D3也可以抑制PTH的合成,防止肾磷酸盐重吸收减少和PTH引起的尿磷酸盐排泄增加。同时,高于正常水平的血清磷酸盐会抑制肾脏1α,25-(OH)2-D3的生成,肾脏中的24-羟化酶(CYP24A1)可以对其进行降解[15]。饲料摄入不足、日光减少、高海拔、肥胖以及肠道吸收不良等原因均会导致VD3缺乏[16]。VD3缺乏会导致多种疾病发病率和流行病的易感程度增高[17],亚生理浓度的1α,25-(OH)2-D3会引起部分氧化应激、自噬、炎症、线粒体功能障碍[18]、DNA损伤以及活性氧(ROS)的过量产生。因此,适宜的1α,25-(OH)2-D3浓度对畜禽生产具有重要意义。2维生素D3抗氧化作用氧化应激指ROS的产生与清除失衡[19]。在高密度集约化饲养模式下,断奶、免疫应激和细菌病毒感染等因素易造成畜禽出现氧化应激反应,导致细胞膜结构和功能的完整性受损、蛋白质和核酸氧化损伤,造成组织功能异常和机体抗病力下降[20]。VD3可以下调氧化应激标志物与炎症因子浓度,在调节肝脏氧化应激和炎症反应中发挥重要作用[21]。在铅(Pb)对睾丸的毒性模型中,连续4 w给小鼠隔日肌注1 000 IU/kg VD3,可以通过调控Nrf2和NF-κB表达缓解氧化应激和炎症反应[22]。在猪日粮中补充50 μg/kg 25-(OH)-D3,可以提高猪肉抗氧化状态[23]。Hansen等[24]研究表明,给母鸡饲喂22 000 IU/kg VD3可以缓解热应激。饲喂25 μg/kg 1α,25-(OH)2-D3可以显著提高早期肉鸡血清和肝脏中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)活性,降低血清中丙二醛(MDA)含量[25]。VD3的抗氧化功能的分子机制可能与其能够促进Nrf2[26]和Klotho的表达相关。VD3能够通过提高Nrf2表达避免畜禽发生氧化应激[27]。转录共激活因子PGC-1α与Nrf2相互作用形成复合物能够调控线粒体脱乙酰基酶(SIRT3),直接参与氧化应激循环[28]。SIRT3的上调会增强FoxO3a和SOD2的脱乙酰基作用,增强SOD2的表达,导致ROS减少,其中VD3的代谢产物会影响整个过程,且线粒体Nrf2/PGC-1α-SIRT3路径的激活取决于细胞内1α,25-(OH)2-D3的浓度[29]。Klotho是1种跨膜蛋白,包含1个大的细胞外结构域,能够调节细胞信号系统,促使抗氧化分子形成,降低ROS含量[30]。胞外域脱落后,该外部域被释放以作为体液因子来控制胰岛素生长因子、cAMP信号通路[31]。Klotho通过抑制胰岛素生长因子通路,增加FOXO的激活,增强抗氧化酶的表达,如SOD2和过氧化氢酶[32];还可以通过cAMP途径调节SOD2、Nox2水平[33]。VD3促进Klotho蛋白的表达来降低ROS含量,达到抗氧化应激的作用。VD3缺乏期间的保护作用会下降,导致细胞异常活化[34]。因此,畜禽饲养期间确保VD3的充足供应尤为重要。3维生素D3对糖脂代谢的调控作用VD3具有影响脂肪和糖代谢的生物学功能。有报道根据糖化血红蛋白与2型糖尿病(T2DM)患者的VD3状态呈负相关,推测VD3的水平可能在血糖控制中发挥作用[35]。Maestro等[36]研究表明,VD3可以通过直接刺激胰岛素受体基因调节胰岛素作用,并增强机体对胰岛素的敏感性,而VD3缺乏会降低岛素受体基因表达和胰岛素分泌,表明VD3缺乏在T2DM的发展中起重要作用[37]。肌肉和脂肪组织中的VDR和VD3会影响葡萄糖的利用[38]。VDR基因多态性与胰岛素分泌能力的初步相关性表明,VDR基因型可能是外周血单个核细胞中VDR mRNA和蛋白水平的重要决定因素[39]。VD3还可以通过多种方式调节与糖尿病相关的胰岛素抵抗途径,作为PPAR家族成员的过氧化物酶体增殖物激活受体δ(PPAR-δ),通常与VDR共表达[40]。1α,25-(OH)2-D3能够增加PPAR-δ基因的表达,而PPAR-δ对脂肪分解和脂肪酸氧化有积极影响。在脂肪形成条件下,来自VDR敲除小鼠的骨髓基质细胞(BMSC)会表达出更高的过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)mRNA水平和脂肪形成分化标志物,VDR通过增强经典Wnt信号通路的表达来抑制BMSC的脂肪生成[41]。VD3被认为是糖尿病患者的脂联素促分泌因子[42]。1α,25-(OH)2-D3补充剂会上调SIRT1表达和AMPK磷酸化水平,促进高糖处理的脂肪细胞中的GLUT4表达和葡萄糖摄取。此外,VD3的补充显著上调喂食高脂饮食的小鼠脂肪组织中的pAMPK、SIRT-1和 GLUT-4水平[43]。在畜禽领域中,VD3对脂肪和糖代谢的生物学功能存在很大的应用潜力。4维生素D3对先天免疫功能的影响在畜禽养殖过程中,先天免疫是畜禽抵御感染的第1道防线。VD3通过合成全身性1α,25-(OH)2-D3或25-(OH)-D3局部转化为1α,25-(OH)2-D3发挥其免疫功能[44],从合成1α,25-(OH)2-D3的组织特异性特点证明其对先天免疫系统和适应性免疫系统均很重要[45]。1α,25-(OH)2-D3的生物学效应由VDR介导,VDR是1种广泛在体内表达的核受体,如肠道[46]和免疫系统的大多数细胞,包括T淋巴细胞(T细胞)、中性粒细胞、树突状细胞和巨噬细胞[47]。VDR和维A酸类X受体(RXR)异二聚化,形成异二聚体复合物,该复合物由1α,25-(OH)2-D3激活,显示出与转录因子类似的活性。此异二聚体复合物与位于靶基因调控区域的同源维生素D3反应元件(VDRE)的结合对调控基因表达至关重要[48]。VD3可以增强免疫细胞趋化性、抗菌肽表达和巨噬细胞分化,从而激活先天免疫反应。4.1维生素D3与免疫细胞免疫细胞包括巨噬细胞、树突状细胞和活化的T细胞,会表达细胞内VDR,并对1α,25-(OH)2-D3反应。1α,25-(OH)2-D3/VDR介导树突状细胞成熟的生理相关抑制,该抑制可以抵抗成熟,刺激并调节抗原特异性免疫应答[49]。1α,25-(OH)2-D3可以调节髓样树突状细胞,抑制T细胞进一步活化[50]。1α,25-(OH)2-D3具有抑制成熟和抗原呈递能力,可以增加成熟树突状细胞的凋亡,因此被认为可以促进免疫耐受[51]。1α,25-(OH)2-D3对活化的T细胞具有直接的协同作用,是有效的抗炎剂和适应性调节性T细胞的生理诱导剂[52]。Toll样受体(TLR)是1个模式识别受体家族,可以识别病原体特异性分子基序并刺激先天免疫反应。1α,25-(OH)2-D3使伤口周围的角质形成细胞通过TLR2识别微生物成分并分泌抗菌肽产生应答[53]。许航[54]通过VDR调控TLR4/NF-κΒ信号通路发现,1α,25-(OH)2-D3灌胃使小鼠紧密连接蛋白Claudin-1表达上调,NF-κΒ、MyD88蛋白表达下调,血清和肠道中炎症因子下降。VD3作为免疫调节剂对改善鸡的先天免疫反应具有有益效果[55]。在饲料中添加3 000 IU VD3/kg可以保护蛋鸡免受脂多糖诱导的免疫应激[56]。通过1α,25-(OH)2-D3和VDR对T细胞、巨噬细胞和树突状细胞的调节,证明VD3可以在畜禽养殖过程中起到保护作用。4.2维生素D3与炎症在畜禽养殖过程中,炎症的发展会对畜禽生产造成损失,尤其是炎症性肠病(IBD)。VD3对IBD具有有益作用,在小鼠模型中,1α,25-(OH)2-D3可以调节胃肠道微生物群功能[57]。1α,25-(OH)2-D3的局部和内分泌合成均会影响小鼠结肠炎的发展,VDR状态会影响小鼠结肠炎的发展和T细胞在肠道中的归巢[58],稳定肠上皮细胞中的细胞紧密连接结构[59]。NF-κB通路受1α,25-(OH)2-D3和VDR调控,因为VDR-p65相互作用有助于抑制p65活性[60]。细胞中缺失VDR会导致NF-κB抑制剂IκBα蛋白减少[61],IκBα蛋白可以减少呼吸道合胞病毒诱导气道上皮中NF-κB驱动的基因[62]。VD3通过NF-κB途径参与抗呼吸道感染[63]。同时,VD3可以在清除病毒的同时减少病毒感染时的炎症反应[64]。在炎症区域,适当浓度的1α,25-(OH)2-D3可以通过减少M1巨噬细胞产生的促炎因子和增加M2巨噬细胞产生的抗炎细胞因子合成,重构M1和M2巨噬细胞比例的平衡[65]。此外,1α,25-(OH)2-D3可以减少细胞增殖并增强细胞分化,这是VD3抗癌作用的关键[66]。使用流感病毒攻击小鼠后,高剂量25-(OH)-D3喂养的小鼠肺部病毒滴度明显低于标准喂养小鼠肺部,促炎因子白细胞介素-5(IL-5)和γ干扰素(IFN-γ)含量显著下调,抗炎因子未显著上调,表明25-(OH)-D3抑制炎性细胞因子的产生并减少病毒复制和病毒感染[67]。Rai等[68]研究表明,给猪额外补充VD可以减轻炎症和脂肪浸润,保护膝关节组织结构。4.3维生素D3与抗菌肽抗菌肽(AMP)作为替抗药物受到广泛关注。大量研究表明,1α,25-(OH)2-D3可以诱导AMP基因表达。1α,25-(OH)2-D3在分离的人类角质形成细胞、单核细胞和中性粒细胞以及人类细胞系中诱导AMP基因表达[69]。VD3可以诱导肝杀菌肽和嗜中性多肽表达[70]。AMP和防御素基因的启动子包含共同的VDRE,可以介导1α,25-(OH)2-D3依赖性基因表达,有研究检查上皮细胞、巨噬细胞、单核细胞和中性粒细胞,其中VD3强烈刺激AMP表达,而防御素的促表达调节更为温和[71]。在肠道中,1α,25-(OH)2-D3可以诱导肠上皮细胞、Paneth细胞和上皮内淋巴细胞产生和分泌AMP[72],提高肠上皮细胞的活力,减轻细菌脂多糖对肠道的损害[73]。VD3还可以增强膀胱中的LL-37以防止细菌进入膀胱[74]。在牛乳腺上皮细胞中,VD3可以降低金黄色葡萄球菌的内化,差异调控抗菌肽在牛乳腺上皮细胞中的表达[75]。VD3可以诱导鸡防御素基因在胚胎肠上皮细胞和外周血单个核细胞中表达[76]。在猪饲粮中添加5 000 IU/kg VD3,可以通过调节TBK1/IRF3信号通路介导机体抗病毒先天免疫减轻轮状病毒感染[77]。5展望我国饲料端禁抗的实施会增加畜禽养殖的风险,间接提高养殖成本。VD3作为畜禽饲料中必需的添加剂,可以通过激活机体抗氧化反应、调节糖脂代谢以及促进先天免疫来提高畜禽在禁抗背景下的抗病力,降低养殖风险,提高畜禽生产效率。因此,VD3是1种具有广阔应用前景的饲料添加剂。未来应从以下两方面探究VD3在畜禽养殖中的应用:其一,在不同种类的畜禽中比较研究不同VD3用于饲料添加剂的剂量和添加形式,尤其要注意VD3的毒副作用;其二,探究添加不同VD3时最合理的成本效益比。

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