锦鲤(Cyprinus carpio haematopterus)是主要生活在亚热带和温带区的淡水观赏鱼类[1]。黄粉虫(Tenebrio molitor)又称面包虫,蛋白质含量可达40%~60%,黄粉虫中含有多种微量元素,是替代鱼粉的优质蛋白饲料源[2]。随着人们对水产动物的需求量增加,水产养殖业迅速发展,因此,对水产饲料的需求量激增。鱼粉是为鱼类提供营养的重要来源[3]。但是,由于鱼粉资源的紧缺,寻找新型的营养源成为亟待解决的问题[4]。昆虫类蛋白源具有高蛋白、高脂、来源丰富、价格低廉的优势[5]。黄粉虫的氨基酸组成相对均衡,且含有丰富的亚油酸,对鱼类生长发育起到重要的作用。黄粉虫是可以利用生物废弃物生长的资源昆虫[6],在水产动物饲料中应用的潜力巨大,是替代鱼粉的最佳选择。本试验以黄粉虫替代鱼粉,测定黄粉虫对锦鲤非特异性指标、抗氧化指标及抗炎因子指标的影响,探究黄粉虫在锦鲤饲料中替代鱼粉的可行性,为黄粉虫在锦鲤饵料中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料试验锦鲤由天津市精武镇观赏鱼示范区提供,运至学校后消毒处理,暂养1 w,使其适应环境。选取体重(55.49±2.28)g、体长(114.127±4.06)cm的试验锦鲤。黄粉虫干虫由天津市水产研究所里自沽农场提供。1.2试验设计锦鲤经过暂养、测量外部指标,选出健康、规格基本一致的360尾锦鲤,随机分为6组,每组3个重复,每个重复20尾鱼。各组黄粉虫替代鱼粉比例为0(G1组)、20%(G2组)、40%(G3组)、60%(G4组)、80%(G5组)、100%(G6组)。饲养56 d。基础饵料购自天津市宝坻晨辉工厂,试验饵料组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.013.T001表1试验饵料组成及营养水平(风干基础)项目G1组G2组G3组G4组G5组G6组原料组成褐鱼粉15.012.09.06.03.00黄粉虫03.06.09.012.015.0虾粉7.07.07.07.07.07.0小麦7.36.45.54.73.93.5豆粕25.527.028.530.031.532.5面粉10.010.010.010.010.010.0谷朊粉12.012.012.012.012.012.0淀粉2.02.02.02.02.02.0豆油3.22.62.01.30.60多维1.01.01.01.01.01.0多矿4.04.04.04.04.04.0菜籽9.09.09.09.09.09.0玉米4.04.04.04.04.04.0合计100.0100.0100.0100.0100.0100.0营养水平粗蛋白50.850.250.450.650.350.7粗脂肪17.118.218.018.217.417.1灰分7.98.08.18.07.98.0水分23.923.123.123.024.024.0注:1.多维、多矿购自天津市晨辉饲料有限公司。2.营养水平均为实测值。%饵料投饲率为2%~3%,每天投喂2次,每天换水1/3~1/2,水温控制在(28.5±1)℃。1.3样品采集每组选取15尾锦鲤,尾柄取血,4 ℃、4 000 r/min离心10 min,-80 ℃冰箱保存,待检测。低温下进行解剖收集锦鲤肝脏,-80 ℃冰箱保存。测定组织样品时使用电动匀浆机研磨,其肝脏与生理盐水比例为1∶9,把匀浆液倒入离心管中,4 ℃、2 000 r/min离心10 min,吸取上清液进行指标测定。血浆可直接进行检测。1.4测定指标及方法测定血浆与肝脏中过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、溶菌酶(LZM)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT),试剂盒均购自南京建成科技有限公司;测定血浆前列腺素F2a(PGF2a)、前列腺素E2(PGE2)、补体C5a受体(C5aR)、补体C3受体(C3a)、白介素-6(IL-6)含量,试剂盒均购自南京建成科技有限公司。1.5数据统计与分析试验数据采用Excel及SPSS 17.0进行分析处理,对所有数据进行单因素方差分析(One-way ANOVA),使用Duncan's法进行多重比较,结果以“平均值±标准差”表示,P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1黄粉虫对锦鲤血浆及肝脏非特异性免疫指标的影响(见表2)由表2可知,随着黄粉虫替代鱼粉含量的增加,肝脏中ACP、AKP活性先升高后下降,G2组的AKP和ACP活性显著高于其他组(P0.05)。血浆中的ACP、AKP活性先升高后下降,G3组ACP活性显著高于其他组(P0.05),G2组AKP活性显著高于其他组(P0.05)。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.013.T002表2黄粉虫对锦鲤血浆及肝脏非特异性免疫指标的影响项目G1组G2组G3组G4组G5组G6组血浆AST/(U/L)22.30±2.2016.22±2.5018.75±2.5019.40±3.5019.46±3.5020.86±3.20ALT/(U/L)12.93±1.20a6.83±0.50cd6.11±1.10cd7.52±1.10c7.95±1.10c9.82±1.50bAKP/(金氏单位/100 mL)17.67±0.41c27.78±0.20a24.42±0.15b24.25±0.10b23.27±0.20b20.19±0.15bACP/(金氏单位/100 mL)15.79±0.24c22.43±0.24b27.89±0.29a24.20±0.20b21.32±0.20b20.23±0.21bLZM/(U/L)1.43±0.70c1.82±0.30b2.12±0.20a1.77±0.10b1.70±0.10b1.66±0.10b肝脏AST/(U/g prot)13.42±1.4011.71±1.4010.93±1.3811.47±1.6611.98±0.6012.98±0.85ALT/(U/g prot)63.17±0.85a53.46±0.68b44.26±0.57c53.80±1.00b55.78±0.60b57.68±0.60bAKP/(金氏单位/g prot)37.54±1.09b41.37±0.18a32.44±0.17b26.41±0.20c25.82±0.13c25.20±0.39cACP/(金氏单位/g prot)24.22±2.73b29.60±2.71a14.60±0.12c13.99±0.15c13.84±0.28c13.83±0.08c注:同行数据肩标字母不同表示差异显著(P0.05),字母相同或无字母表示差异不显著(P0.05);表3与此同。血浆及肝脏中,G1组ALT活性显著高于其他组(P0.05),各组的AST活性均无显著差异(P0.05);血浆中LZM活性先上升后下降,G1组LZM活性显著低于其他各组(P0.05);G3组LZM活性显著高于其他各组。2.2黄粉虫对锦鲤血浆及肝脏抗氧化的影响(见表3)由表3可知,血浆及肝脏中,G1组、G2组的SOD活性显著高于其他各组(P0.05)。G3、G4、G5、G6组的CAT活性均显著低于G1、G2组(P0.05)。肝脏中,GSH-Px活性的变化趋势为先升高后降低,G2组的GSH-Px活性显著高于其他各组(P0.05);血浆中,G2组的GSH-Px活性显著高于G1、G6组(P0.05)。血浆中,G2组的MDA含量显著低于G1组,显著高于G3、G4、G5、G6组(P0.05);肝脏中,G1、G2组的MDA含量显著低于其他各组(P0.05)。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.013.T003表3黄粉虫对锦鲤血浆及肝脏抗氧化的影响项目G1G2G3G4G5G6血浆SOD/(U/mL)84.86±1.10b117.3±4.70a64.34±6.80c63.32±3.80c62.43±3.80c61.76±4.10cMDA/(μmol/L)14.69±0.20a12.03±0.50b11.6±0.60c11.44±0.30c11.39±0.40c11.31±0.20cCAT/(U/mL)22.45±0.30a21.13±0.30a19.04±0.40b18.07±0.50b17.93±0.40b16.58±0.40bGSH-Px/(mmol/L)266.90±2.90c380.8±2.50a378.27±1.40a376.81±0.10a367.37±2.90a347.03±2.50b肝脏SOD/(U/mg prot)26.38±1.00a26.52±0.20a14.18±0.10b14.10±0.20b14.5±0.20b13.99±0.60bMDA/(μmol/g prot)1.37±0.40b1.33±0.10b1.41±0.10a1.43±0.10a1.62±0.20a1.65±0.20aCAT/(U/mg prot)6.03±0.60a4.16±0.40a2.09±0.20b1.99±0.20b1.98±0.70b1.88±0.20bGSH-Px/(μmol/g prot)177.20±5.10b235.60±1.60a177.20±3.10b176.20±2.90b176.40±1.90b175.80±1.90b2.3黄粉虫对锦鲤血浆的抗炎因子的影响(见表4)由表4可知,随着黄粉虫替代鱼粉含量的增加,血浆中PGF2a含量呈现下降趋势,G1组显著高于其他各组(P0.05);血浆中G5、G6组C5aR含量显著低于其他各组(P0.05);血浆中G1组C3a含量显著高于其他各组(P0.05)。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.013.T004表4黄粉虫对锦鲤血浆抗炎因子的影响组别PGF2a/(ng/L)PGE2/(ng/L)C5aR/(μg/L)C3a/(μg/L)IL-6/(ng/L)G1组145.05±1.30a301.43±1.404.28±1.89a38.87±9.67a19.30±6.27G2组76.22±4.00b346.30±1.604.30±1.40a25.23±7.31b20.30±11.30G3组75.53±1.60b434.25±2.904.61±2.20a24.98±2.13b20.53±4.30G4组64.42±2.80b355.68±1.303.73±0.97a24.03±6.63b21.42±4.10G5组38.53±1.60b292.37±1.700.69±0.16b23.13±8.76b20.53±3.40G6组37.98±9.70b270.34±1.100.55±0.13b22.97±3.16b19.50±2.45注:同列数据肩标字母不同表示差异显著(P0.05),字母相同或无字母表示差异不显著(P0.05)。3讨论3.1黄粉虫对锦鲤血浆及肝脏非特异性免疫的影响AST、ALT是判断鱼类肝功能有无疾病和生理状况是否健康的主要标志,肝脏受损时,ALT、AST活性明显提高[7-8]。本试验中,40%黄粉虫替代鱼粉的锦鲤,血浆和肝脏中ALT活性显著低于其他组,各组AST无显著性变化,表明肝脏健康状况有所好转,与黄旺[9]得出的基础饵料中添加50%黄粉虫替代鱼粉不会对鱼类的肝脏造成影响的结果一致。AKP是一种水解酶,能够把鱼类体内的各种细菌消除降解,有助于鱼类对葡萄糖、钙的吸收[10-11]。ACP称为酸性磷酸酶,不仅参与磷酸酯的代谢,还参与其他的生长代谢[12]。本试验中,G2组血浆和肝脏中的AKP活性最高;G3组血浆中ACP活性最高,G2组肝脏中ACP活性显著高于其他组。本研究表明,添加20%~40%黄粉虫可以提高血浆和肝脏中ACP和AKP活性,增强锦鲤的非特异性免疫力。曹振杰等[13]研究发现,添加黄粉虫虫粉及虫壳可提高南美白对虾ACP和AKP活力。白燕等[14]研究表明,在刺参基础饵料中添加黄粉虫能够显著增强刺参的生长性能。上述研究均与本试验研究结果相似。原因可能与黄粉虫中含有抗菌肽[15]及免疫活性因子对免疫系统的调控起重要的作用[16]。LZM是一种不耐热的碱性蛋白质,能够破坏和消除入侵体内的异物令病毒失活[17]。本试验中,血浆中的LZM随黄粉虫替代鱼粉含量的增加,出现先增高后降低的趋势,G2、G3、G4、G5、G6组显著高于G1组,且G3组LZM活性最高。黄粉虫体内除了含有丰富的常规营养物质以外,还含有大量的甲壳素[2]。甲壳素及其衍生物壳聚糖具有降血脂、提高免疫力、避免炎症发生[18]的优点,说明添加黄粉虫中的甲壳素可提高溶菌酶的活力。3.2黄粉虫对锦鲤血浆和肝脏抗氧化功能的影响CAT、SOD和GSH-Px是3种在抗氧化平衡中不可或缺的酶[19]。SOD活性是间接说明抗氧化和氧化平衡的标志,SOD活性的高低也能说明机体自身的清除自由基的能力,预防细胞与机体受到伤害[20]。CAT可以通过H2O2的催化反应,使其分解成H2O和O2从而将机体中多余的H2O2剔除出去[21]。GSH-Px是1种在机体内广泛存在的酶,主要作用是催化过氧化氢分解、稳定细胞膜的结构及维护巯基酶的活性。MDA是天然的脂质过氧化物氧化分解而来的产物。机体受到的损伤程度及细胞间接被自由基攻击的程度和MDA的含量呈正相关性[22]。本试验中,黄粉虫替代鱼粉的含量增加,血浆和肝脏中的CAT活性和SOD活性显著下降(除G2组),说明20%黄粉虫替代鱼粉不会对鱼体的健康造成影响,与唐扬等[23]研究的黄粉虫替代鱼粉对牛蛙机体造成损伤的结果一致。血浆中的GSH-Px含量显著上升,说明不同比例的黄粉虫替代鱼粉后,会提高细胞中氧自由基等生物活性因子的含量和抗氧化酶的浓度,使GSH-Px活性提高[24]。血浆中的MDA含量和肝脏中G2组MDA含量显著下降,说明黄粉虫可有效地增强机体抗氧化能力,对生物膜结构的完整具有重要的保护作用。胡俊茹[25]在以黑水虻幼虫粉替代鱼粉的研究中也得到同样结果。肝脏中的MDA含量显著升高,说明锦鲤机体内脂质过氧化物质的积累量增多,细胞膜受到不同程度的损伤,影响鱼体自身抗氧化能力。3.3黄粉虫对锦鲤血浆的抗炎因子的影响前列腺素PGF2a是前列腺素类的代谢产物,存在于血浆及各体液中[26]。前列腺素PGF2α呈现升高的趋势,会导致肌肉疼痛、血管收缩,并伴有痉挛性疼痛[27]。本试验结果表明,血浆中前列腺素PGF2a随黄粉虫替代鱼粉的含量增加呈下降的趋势,说明黄粉虫会使鱼类体内脂肪酸减少导致PGF2a浓度降低[28]。前列腺素E2(PGE2)有利于鱼体血管的舒张及血液流通,有很好的免疫防御和抗炎功能。补体受体C3a和C5a主要分布在肥大细胞、单核巨噬细胞和内皮细胞中,对补体的吞噬作用、免疫调控作用和激活炎症效应发生介导[29]。本试验中,补体受体C3a、C5a含量随黄粉虫取代鱼粉的含量的增加,血浆中G1、G2、G3、G4组的C5a含量无显著性差异,但从G5组显著下降;血浆中G2、G3、G4、G5、G6组C3a含量显著低于G1组,说明黄粉虫代替鱼粉过量会引起补体浓度下降,不利于补体免疫调控作用和激活炎症效应。本试验与郭志强等[30]和刘莉如[31研究的抗菌肽可提高公鸡和肉兔中C3、C5补体的活性的结果不同,可能是黄粉虫的不饱和脂肪酸过高抑制了抗菌肽的表达[32]。白细胞介素在鱼体免疫反应应答方面起到重要作用。在激活抗炎细胞和分化免疫细胞具有调节作用[33]。本试验中,鱼体血浆中白细胞介素IL-6未显示出各组间差异显著性,说明黄粉虫代替鱼粉对鱼体白细胞介素IL-6无太大的影响。4结论本试验通过黄粉虫对锦鲤血浆和肝脏的非特异性、抗氧化以及抗炎因子的影响结果,得出黄粉虫替代20%~40%的鱼粉较为适宜。
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