胡枝子（Lespedeza bicolor）又称胡枝条，为多年生半灌木或灌木。胡枝子树丛高约0.5~3.0 m，分支多而细长，枝叶呈黄色或暗褐色，有耐寒、耐阴、耐干旱、耐贫瘠等特点。胡枝子的根系发达，有保持水土的作用[1]。胡枝子产量丰富，粗蛋白质、钙、磷含量均较高，纤维素含量较低。开花期胡枝子叶含粗蛋白质13%~17%，含粗纤维24%~25%，制成草粉可饲喂猪、兔、鸡。牛、羊可以直接采食胡枝子嫩茎，胡枝子是家禽家畜优质的青饲料[2]。胡枝子含有多种氨基酸，具有较高含量的粗蛋白质，营养价值很高[3]。胡枝子中有较高含量的缩合单宁[4]。缩合单宁对过瘤胃蛋白起到保护作用，能够减少甲烷的排放量，提高能量的利用率，同时降低反刍动物瘤胃胀气的发病率[5]。胡枝子作为含单宁的饲草，存在一种水溶性酚类物质是植物次生代谢后的产物。目前，对胡枝子的研究大部分为综合护坡能力、土壤质量修复力等[6-7]，在畜牧领域的研究较少。本试验检测缩合单宁和营养物质含量变化，并利用体外培养法分析胡枝子对延边黄牛瘤胃发酵指标的影响，旨在为胡枝子饲用价值的评定和新型饲料资源的进一步开发和利用提供参考。1材料与方法1.1试验材料2020年6、7、8、9月初在吉林延边长白山地区采集胡枝子，取鲜嫩枝条用带有冰块的保鲜盒密封带回试验室。于-80 ℃保存部分胡枝子鲜样，其余样品采集叶片后，使用冷冻干燥机干燥，粉碎，过40目筛，存放于密封袋中，4 ℃避光保存，做好标记，备用。1.2养分分析方法使用重量法对胡枝子的水分含量进行测定；采用550 ℃灼烧法对粗灰分（Ash）含量进行测定；参照Van Soest法测定胡枝子中的中性洗涤纤维（NDF）与酸性洗涤纤维（ADF）含量；采用凯氏半微量定氮法对胡枝子中粗蛋白质（CP）含量进行测定；取粉碎好的胡枝子样品经超声波处理，制成上清液，Folin-Ciocalteu试剂比色法测定饲草中总酚含量，取上清液经不溶性聚维酮处理，并用同样的方法测定简单酚含量；采取Vanilli-HCl法测定缩合单宁含量[8]。1.3试验动物选用3头健康无病、体况良好、安装永久瘤胃瘘管的延边黄牛，体重约455 kg。基础日粮按照NRC（2000）配制，保证其中不含有缩合单宁。基础日粮组成及营养水平见表1。养殖人员每天7：30和16：30对试验动物定时饲喂，自由饮水，正常光照。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.001.T001表1基础日粮组成及营养水平原料组成含量/%营养水平合计100.00秸秆青贮70.15综合净能/(MJ/kg)8.06玉米20.15粗蛋白质/%11.59小麦麸3.55钙/%0.87豆粕4.05磷/%0.32棉籽粕1.60食盐0.50注：营养水平均为计算值。1.4试验方法1.4.1体外发酵试验当天晨饲前2 h，采集3头延边黄牛的瘤胃液，均匀混合，置于39 ℃恒温保温箱中厌氧保存备用。将经4层纱布过滤后的瘤胃液30.00 mL，与人工培养液按1∶2比例混合[9]，加入冷冻干燥胡枝子样品粉末2.00 g的体外培养瓶中，密封压盖，39 ℃恒温培养箱中培养72 h。1.4.2体外培养液的取样体外发酵的3、6、12、24、36、48和72 h采集气体样品和培养液样品。气体采用无抗凝剂采血管收集，用于甲烷产量的测定。采用移液器吸取培养瓶中瘤胃液1.00 mL置于1.5 mL离心管中；采用移液器吸取0.8 mL瘤胃液加入盛有0.2 mL偏磷酸（25%）溶液的1.5 mL离心管中，于-80 ℃环境下保存，前者用于氨态氮（NH3-N）的分析，后者用于挥发性脂肪酸（VFA）的分析。另取10 mL培养液于15 mL离心管中，-80 ℃保存，备用。1.4.3发酵指标及测定方法使用酸度计（萧山，pHS-3B）对pH值进行测定；用100 mL玻璃注射器插入橡胶塞子直接读取培养瓶中微生物产气量；参照Callaway和Martin方法，使用气相色谱仪（岛津GC-2014C），采用外标法对气体水平进行测定；参照靛酚比色法对氨态氮进行测定；采用气相色谱（Agilent 6890 A）外标法测定挥发性脂肪酸[8]。1.5数据统计与分析采用Microsoft Excel 2007软件对数据预处理，采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析（One-way ANOVA），采用LSD法进行多重比较，结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1不同收获时期胡枝子单宁及营养物质含量变化（见表2）由表2可知，7月和8月胡枝子中缩合单宁含量极显著高于6月和9月（P0.01）；6月胡枝子中水分和粗蛋白质的含量极显著高于其他3个收获期（P0.01）；6月胡枝子中酸性洗涤纤维的含量极显著低于其他3个收获期（P0.01）；9月胡枝子中的中性洗涤纤维含量极显著高于其他3个收获期（P0.01）；6月胡枝子中的粗灰分的含量极显著低于8月和9月（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.001.T002表2不同收获时期胡枝子缩合单宁及营养物质含量变化收获期缩合单宁/(g/kg DM)水分/%粗蛋白质/% DM中性洗涤纤维/% DM酸性洗涤纤维/% DM粗灰分/% DM平均值7.5266.8514.7337.2129.337.916月7.17±0.19B79.11±0.19A20.50±0.44A34.71±0.63B23.87±0.71C7.40±0.36B7月8.33±0.47A71.50±1.08B16.09±0.53B35.00±1.89B26.92±0.45B7.73±0.08AB8月7.58±0.29A62.53±0.52C12.30±1.35C35.69±1.06B32.40±1.32A8.28±0.10A9月7.01±0.19B54.26±0.72D10.03±0.95C43.44±1.37A34.12±0.39A8.24±0.08A注：同列数据肩标不同大写字母表示差异极显著（P0.01），不同小写字母表示差异显著（P0.05），字母相同或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.2不同收获时期胡枝子对延边黄牛瘤胃发酵pH值的影响（见表3）由表3可知，随着体外发酵的进行，4个收获时期的胡枝子在各个时间点的瘤胃发酵pH值均为下降趋势。瘤胃体外发酵3、6、12、24、36、72 h时，6月胡枝子瘤胃发酵pH值极显著低于其他3个收获时期（P0.01）；体外发酵12 h，7月和8月胡枝子瘤胃发酵pH值极显著高于6月和9月（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.001.T003表3不同收获时期胡枝子对延边黄牛瘤胃发酵pH值的影响收获期3 h6 h12 h24 h36 h48 h72 h6月6.57±0.02Bb6.33±0.08Bb5.75±0.03Cc5.57±0.01D5.57±0.01Cc5.56±0.01Bb5.51±0.01Bb7月6.71±0.01Aa6.57±0.03Aa6.36±0.01Aa6.08±0.01A5.84±0.04Aa5.68±0.01Aa5.57±0.01Aa8月6.72±0.01Aa6.55±0.04Aa6.33±0.01Aa5.91±0.03B5.69±0.01Bb5.58±0.01Bb5.55±0.02Aa9月6.68±0.04Aa6.51±0.02Aa6.21±0.01Bb5.78±0.04C5.66±0.02Bb5.57±0.01Bb5.55±0.01Aa2.3不同收获时期胡枝子对延边黄牛瘤胃发酵NH3-N含量的影响（见表4）由表4可知，4个收获时期的胡枝子瘤胃液NH3-N含量均呈先下降后上升的趋势。在瘤胃体外发酵的各个时间点，6月胡枝子瘤胃发酵NH3-N含量均极显著高于其他3个收获时期（P0.01）；在发酵72 h时间点，各收获时期胡枝子瘤胃发酵NH3-N含量均呈极显著差异（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.001.T004表4不同收获时期胡枝子对延边黄牛瘤胃发酵NH3-N含量的影响收获期3 h6 h12 h24 h36 h48 h72 h6月129.0±0.6Aa114.5±1.1Aa131.7±2.1Aa197.0±16.7Aa264.5±6.6Aa284.4±21.9Aa284.8±2.0A7月104.2±5.3Bb95.7±0.7Bb59.8±2.1Bc52.8±0.9Bc95.9±8.2Bb113.6±2.1Bb181.1±0.8C8月103.8±2.0Bb91.1±4.0Bbc57.8±0.3Bc65.6±1.0Bbc76.9±12.9Bc79.8±0.7Bc146.6±4.3D9月109.3±1.2Bb88.5±3.9Bc65.8±3.8Bb70.1±1.0Bb106.2±3.3Bb135.0±13.1Bb197.0±0.2Bmg/L2.4不同收获时期胡枝子对延边黄牛瘤胃发酵总产气量的影响（见表5）由表5可知，随着发酵时间的进行，4个收获时期的胡枝子体外产气量均增多。瘤胃体外发酵3 h，7月胡枝子体外产气量显著高于9月（P0.05），并极显著高于6、8月（P0.01）。体外发酵6 h，8月胡枝子体外产气量极显著低于其他3个收获时期（P0.01）；体外发酵12、24、36、72 h，6月胡枝子产气量极显著高于其他3个收获时期；发酵48 h，6月胡枝子产气量最高，显著高于8月（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.001.T005表5不同收获时期胡枝子对延边黄牛瘤胃发酵总产气量的影响收获期3 h6 h12 h24 h36 h48 h72 h6月17.00±0.99Bb42.67±12.21Aa131.67±3.50A168.00±5.56Aa197.00±1.99Aa200.67±9.01Aa229.67±3.05Aa7月22.00±0.99Aa34.33±0.57Aab73.33±1.15B139.67±8.50Bb176.67±4.92Bb193.00±4.99Aab200.33±3.50Bc8月17.67±1.52Bb25.33±3.05Bb53.00±0.99D102.33±0.57Cd153.33±1.15Cd180.33±9.01Ab207.00±1.99Cb9月21.33±1.52Ab29.67±1.52Ab63.33±2.07C129.00±2.64Bc169.00±3.60Bc194.00±9.84Aab209.00±1.99BbmL2.5不同收获时期胡枝子对延边黄牛瘤胃发酵总甲烷产量的影响（见表6）由表6可知，随着发酵时间的推进，4个收获时期的胡枝子甲烷产气量均增多。瘤胃体外发酵3 h，9月胡枝子瘤胃发酵甲烷产量极显著高于7、8月（P0.01）；瘤胃体外发酵6、12 h，6月胡枝子甲烷产量极显著高于其他3个收获期（P0.01）；8月胡枝子瘤胃发酵甲烷产量在体外发酵12、24 h时极显著低于其他3个收获期（P0.01）；体外发酵36 h，6、8月胡枝子瘤胃发酵甲烷产量均极显著低于7月和9月（P0.01）；瘤胃体外发酵48 h，6月胡枝子瘤胃发酵甲烷产量极显著低于7月和9月（P0.01）；体外发酵72 h，6月胡枝子甲烷产量显著低于7月（P0.05），极显著低于8月和9月（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.001.T006表6不同收获时期胡枝子对延边黄牛瘤胃发酵总甲烷产量的影响收获期3 h6 h12 h24 h36 h48 h72 h6月31.12±0.64ACab95.08±4.60Aa215.03±25.31Aa642.46±23.38Aa770.33±22.72Bb838.94±30.88Bc932.60±25.97Bc7月28.77±3.82BCbc61.75±3.15Bb199.24±8.05Bb666.20±12.79Aa951.28±13.64Aa1 049.49±14.73Aab1 119.48±14.51ABb8月24.93±1.92Bc45.65±3.74Bb132.95±2.00Cc467.23±2.23Bb808.61±9.29Bb1 014.73±9.91ABb1 160.44±10.10Aab9月35.08±0.68Aa56.26±4.08Bb177.45±16.31Bb643.37±14.07Aa1 031.50±10.48Aa1 206.87±23.76Aa1 306.70±21.70Aaμmol2.6不同收获时期胡枝子对延边黄牛瘤胃发酵挥发性脂肪酸含量的影响（见表7）由表7可知，随着时间的进行，4个收获时期胡枝子瘤胃液总挥发性脂肪酸、乙酸、丙酸、丁酸含量均上升，乙酸/丙酸值先下降后上升。瘤胃发酵3、12、24、36、48、72 h，6月胡枝子总挥发性脂肪酸含量均极显著高于其他3个收获期（P0.01）。瘤胃发酵3、12、24、72 h，6月胡枝子乙酸含量均极显著高于其他3个收获期（P0.01）；瘤胃发酵48 h，6月胡枝子乙酸含量极显著高于7月和8月（P0.01）。6月胡枝子丙酸含量在各时间点均极显著高于其他收获时期（P0.01）。除瘤胃发酵6 h，其他各时间点6月胡枝子丁酸含量均极显著高于其他3个收获期（P0.01）。6月胡枝子乙酸/丙酸值在各时间点均极显著低于其他收获时期（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.001.T007表7不同收获时期胡枝子对延边黄牛瘤胃发酵挥发性脂肪酸含量的影响项目时间/h6月7月8月9月总挥发性脂肪酸/(mmol/L)335.57±0.32Aa28.61±1.22Bc27.82±0.09Bc30.17±0.16Bb638.39±3.41Aa37.85±1.44Aab36.10±2.63Aab33.21±2.10Ab1266.05±1.18Aa51.51±2.33Bb44.98±2.38Bc47.44±0.27Bc2481.21±2.04Aa65.59±3.66Bb59.33±0.22Bc65.00±1.95Bc3683.16±3.30Aa73.40±2.85Bb72.92±4.13Bb75.69±1.64ABb4889.30±0.20Aa78.27±0.66Bb74.61±0.27Cc79.75±1.64Bb7295.11±1.33Aa83.53±1.34Bb80.19±1.29Bc83.10±2.13Bbc乙酸/(mmol/L)326.09±0.27Aa21.76±0.90Bbc21.35±0.13Bc22.69±0.26Bb627.23±2.01ABab28.28±1.11Aa27.36±2.07ABab24.54±1.46Bb1245.44±0.8Aa38.22±1.62Bb33.64±1.70Cc34.22±0.18Cc2454.03±1.38Aa47.77±3.20Bb43.71±0.12Bc46.61±1.44Bbc3655.00±2.3452.44±1.8252.83±2.8953.91±0.194860.71±0.20Aa56.28±0.57BCbc54.70±0.59Cc58.15±2.00ABb7264.81±0.85Aa61.19±1.04Bb60.18±1.20Bb60.89±1.74Bb丙酸/(mmol/L)37.15±0.89Aa5.36±0.26BCc5.03±0.06Cd5.72±0.01Bb69.12±1.11Aa7.66±0.24Bb6.98±0.46Bb6.95±0.51Bb1216.02±0.09Aa10.32±0.59Bb8.86±0.55Cc10.61±0.09Bb2420.24±0.40Aa13.30±0.13Bb11.74±0.08Cc13.79±0.33Bb3620.30±0.77Aa15.42±0.73Bb14.75±0.92Bb15.82±0.33Bb4820.90±0.18Aa15.86±0.04Bb14.35±0.30Cc14.86±0.74Cc7219.35±0.26Aa14.97±0.16Bb13.43±0.04Cc14.60±0.23Bb丁酸/(mmol/L)31.98±0.08Aa1.38±0.06Bbc1.33±0.01Bc1.51±0.09Bb61.77±0.23Aa1.63±0.05Aab1.49±0.09Ab1.48±0.11Ab123.79±0.07Aa2.53±0.10Bb2.10±0.12Cc2.21±0.01Cc245.50±0.16Aa3.82±0.21Bb3.21±0.02Cc3.74±0.13Bb366.00±0.21Aa4.55±0.22Bb4.28±0.29Bb4.58±0.02Bb485.84±0.11Aa4.87±0.03Bb4.24±0.06Cc4.91±0.18Bb727.92±0.13Aa5.53±0.09Bb4.74±0.03Cc5.41±0.11Bb乙酸/丙酸33.65±0.07Cc4.06±0.04ABb4.24±0.08Aa3.97±0.04Bb63.00±0.14Cc3.69±0.02ABb3.91±0.05Aa3.53±0.05Bb122.84±0.03Cd3.71±0.05Bb3.80±0.05Aa3.23±0.01Bc242.67±0.01Bc3.59±0.20Aa3.73±0.01Aa3.38±0.02Ab362.71±0.05Cc3.40±0.04Bb3.58±0.03Aa3.41±0.08Bb482.90±0.31Bc3.54±0.24Ab3.81±0.12Aab3.93±0.33Aa723.35±0.01Cc4.09±0.04Bb4.48±0.07Aa4.17±0.05Bb注：同行数据肩标不同大写字母表示差异极显著（P0.01），不同小写字母表示差异显著（P0.05），字母相同或无字母表示差异不显著（P0.05）。3讨论3.1不同收获时期胡枝子单宁及营养物质含量变化胡枝子常规营养水平含量在一定程度上反映其提供营养的能力，这对反刍动物极其重要[10]。粗蛋白质含量与饲草的营养价值和饲料转化率呈正比。因此，通过测定粗蛋白质的含量评定饲草的营养价值[11]。胡枝子的营养物质含量随生长而变化。生长初期粗蛋白质含量较高；随着时间的推移，茎叶老化枯萎，细胞内容物减少，细胞壁组成增加，粗蛋白质减少[12]。黄锋华等[13]研究发现，不同牧草蛋白质含量随生长期变化而不断减少。本试验中，粗蛋白质含量随时间推移逐渐减少，与上述研究结果一致。根据牧草蛋白质等级指数划分法：上等牧草CP≥16%，中等牧草10%≤CP≤15%，下等牧草CP≤10%。本试验中，胡枝子6、7月胡枝子中蛋白质含量超过16％，为上等牧草，是适合饲喂家畜的粗饲料资源。3.2不同收获时期胡枝子对延边黄牛瘤胃发酵pH值的影响瘤胃pH值是研究瘤胃发酵内环境的主要指标之一，可以显示饲料在瘤胃中发酵的情形。瘤胃液正常pH值在5.00~7.50范围内变化，且最佳范围为6.00~6.30[14]。当容易发酵的饲草饲料进入瘤胃会降低瘤胃pH值，而纤维分解菌的活性受pH值影响较大，活性降低导致纤维素分解率降低，饲料转化率降低[15]。因此，保持正常的瘤胃pH值是维持瘤胃正常发酵的前提。本试验中，4个月份的胡枝子在体外发酵的过程中瘤胃pH值均在正常变化的范围内，并随着发酵时长的推移逐渐降低呈下降趋势。马敏等[16]研究发现，胡枝子含有较高含量的缩合单宁。单宁作用于瘤胃微生物菌群，过高的单宁含量影响瘤胃正常发酵，使pH值降低。因此，选取适宜月份的饲草对维持瘤胃正常发酵至关重要。3.3不同收获时期胡枝子对延边黄牛瘤胃发酵NH3-N含量的影响瘤胃发酵NH3-N含量是研究瘤胃发酵内环境的重要指标，由饲料中含氮物质的降解和微生物对氨的利用决定。NH3-N含量可以综合反映瘤胃内氮代谢的情况[17]。NH3-N的含量过高表示氨的释放率比其利用速率高，出现氮损失，含量过低则对微生物蛋白的合成起抑制作用，使瘤胃降解率降低。微生物蛋白的合成需要有适宜的NH3-N含量。研究表明，瘤胃NH3-N含量的最适范围是63.0~275.0 mg/L[18]。本试验研究结果显示，NH3-N含量为52.8~284.8 mg/L，处于最适范围内，且含量均呈先下降后上升的趋势，下降是由于发酵初期氮的利用率高，与Wang等[19]的研究结果相似。本试验中，发酵后期，6月胡枝子瘤胃NH3-N含量从12 h开始回升，7月胡枝子瘤胃NH3-N含量从36 h开始回升，而8、9月的胡枝子瘤胃NH3-N含量则在24 h开始回升，可能是由于能量不充足，无法支持微生物利用氨合成蛋白质，导致NH3的积累，使NH3-N含量升高[20]，也有可能是由于细菌溶菌、纤毛虫的溶解和吞噬作用释放出一定量NH3所致[21]。发酵结束后，7、8月胡枝子瘤胃NH3-N的含量明显低于9月，其中一个重要的原因是7、8月胡枝子中缩合单宁的含量高于9月。Dwaville等[22]研究发现，缩合单宁可以提高饲料氮的利用率，与本试验研究结果基本一致。3.4不同收获时期胡枝子对延边黄牛瘤胃发酵总产气量的影响瘤胃发酵产气量可以反映瘤胃中微生物活动的总体趋势和饲料中有机物的可发酵程度[23]，是瘤胃发酵的综合指标。产气量受发酵底物中的碳水化合物的影响较大，但单宁的含量同样可以使产气量发生改变。Nguyen等[24]研究发现，单宁含量在20~40 mg/g时，瘤胃总产气量下降。本试验中，胡枝子7月单宁含量显著高于8月和9月；瘤胃7月产气量高于8、9月，验证了上述结论。主要原因是单宁抑制了瘤胃中微生物的正常活性，使蛋白分解率降低，底物中营养物质的消化利用率降低，最终表现为瘤胃产气量减少[25]。3.5不同收获时期胡枝子对延边黄牛瘤胃发酵总甲烷产量的影响甲烷是菌体蛋白合成过程中利用瘤胃中微生物发酵碳水化合物的产物，通过甲烷菌的种间氢传递而合成[26]。甲烷的产生使家畜容易出现鼓气、不易消化等疾病，也会带来能量损失，并对地球温室效应有影响[27]。研究发现，单宁可以影响甲烷菌的活性，使瘤胃中甲烷菌的数量减少，使甲烷的产量减少[28-29]。本试验中，胡枝子6月单宁含量显著低于7月、8月和9月单宁含量。本研究结果与上述结论出现差异，可能是由于胡枝子中所含单宁的特殊结构或者随生长月的变化单宁相对分子质量和结构的变化有关。6月胡枝子处于生长初期，单宁的相对分子质量较小与氢有更好的结合力或更易于穿透细菌阻止微生物酶的作用[30]。也有研究表明，单宁相对分子质量的大小与体外发酵产气量及甲烷产量呈正比[31]。3.6不同收获时期胡枝子对延边黄牛瘤胃发酵挥发性脂肪酸含量的影响瘤胃中挥发性脂肪酸主要有乙酸、丙酸和丁酸。在反刍动物厌氧消化过程中，甲烷菌主要利用VFA形成甲烷。VFA为反刍动物提供能源，影响瘤胃正常发酵[32]。本试验中，4个收获时期胡枝子瘤胃液总VFA、乙酸、丙酸、丁酸含量均呈上升趋势，乙酸/丙酸值呈先下降后上升趋势，可能是由于单宁抑制瘤胃发酵，引起VFA含量降低，与Slianikove等[33]研究结果相似。4结论6月收割胡枝子可以发挥胡枝子的饲用价值，与7、8、9月相比，可以提高VFA的含量、总产气量和NH3-N含量，降低甲烷产量，能够优化瘤胃环境，保护生态环境，提高饲料利用率，降低能量损失。