抗生素是指由放线菌、真菌和细菌等微生物经过培养得到的次生代谢物质，在很低的浓度下可以对细菌、真菌、立克次体、支原体、衣原体等异源微生物有杀灭和抑制生长作用[1]。农用抗生素（agricultural antibiotics）指具有微生物发酵生产的杀菌剂，是生物源农药重要大类之一[2]。农用抗生素是由微生物产生和分解的一种天然化合物，在自然界容易自然降解，对环境污染小[2-3]。Moore等[4]首次报道，在饲料中添加抗生素能够明显提高肉鸡日增重。抗生素能够提高畜禽的生长速度和饲料转化效率。国内外对抗生素作为饲料添加剂的使用较早。抗生素作为饲料添加剂能够促进动物生长，预防疾病的发生，对促进养殖业的发展有积极作用[5-9]。国家积极推进选育农用新型抗生素研究，服务农业生产[2,10]。试验从土壤中采样筛选获得具有抗菌活性的高拮抗菌株，并对发酵活性产物进行初步抑菌研究、优化培养条件、提高农用抗生素的产量，以期得到新型、高抗、安全的农用抗生素。1材料与方法1.1试验菌种试验所用菌株由宜州区土壤中筛选获得。1.2指示菌种与培养基指示菌种：厚垣镰孢霉（Fusarium chlamydosporum）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、白色念珠菌（Monilia albican），均由微生物及植物资源开发利用广西高校重点实验室提供。培养基：高氏一号培养基制备方法见文献[11-12]；PDA培养基制备方法见文献[11-12]。基础发酵培养基：黄豆饼粉1.00%、葡萄糖1.00%、蛋白胨0.30%、氯化钠0.25%、碳酸钙0.20%，pH值7.2。1.3仪器设备生化培养箱（上海智城分析仪器制造有限公司）、电子数显卡尺（桂林量具刃具有限责任公司）、双层大容量光照摇床（济南东仪实验室设备有限公司）、高速冷冻离心机（美国贝克曼库尔特有限公司）、高压灭菌锅（日本Hirayama公司）、双层恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司）、超净工作台（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）、通用荧光显微镜（日本奥林巴斯显微镜公司）。1.4菌株初筛试验于广西宜州区不同地方不同环境中取样。样品经过预处理，倒进有无菌水的三角瓶中振荡15 min，稀释成10-1~10-5浓度梯度的土壤稀释液[11-12]。吸取0.1 mL10-1~10-5浓度的稀释液，用涂布在有指示菌种的高氏一号固体培养基内，28 ℃培养3~7 d，按时查看是否有抑菌透明圈。用接种环将有抑菌透明圈菌落接种至PDA培养基，28 ℃培养5 d，划线纯化到单菌落。1.5菌株复筛把筛选出的单菌落接种到三角瓶摇瓶发酵，发酵条件为：装液量50 mL/250 mL、摇床28 ℃，160 r/min、发酵4 d，发酵液4 000 r/min、4 ℃高速冷冻离心机离心20 min，倒出上清液，4 ℃保藏，备用[13]。将不同指示菌接种在相应的培养基，取100 μL发酵上清液注进牛津杯，28 ℃恒温培养箱中正置培养1~2 d，依据抑菌圈大小筛选出最好的菌株进行下一步试验。将纯化得到的抑菌圈最大的菌株接在高氏一号斜面上，培养5 d，放入4 ℃的冰箱中保藏[14]。1.6菌株鉴定革兰氏染色、芽孢染色形态特征镜检鉴别方法参考文献[11-12，15-16]。将复筛分离纯化后的菌株划线至高氏一号、PDA、克氏一号合成、葡萄糖-酵母高培养基、查氏培养基和淀粉琼脂培养基[17]。28 ℃下培养2~3 d，并观察菌株以下情况[11-12,18]：气生菌丝体颜色（即袍子丝未形成前的颜色）；浸入培养基的色素的颜色（即可溶性色素的颜色）；菌丝体背面的颜色（即底部菌丝体的颜色）；在其他培养基上的成长趋势（即生长情况）。1.7生理生化鉴定试验开展明胶液化试验、牛奶凝固（胨化）试验、淀粉水解试验、纤维素生长试验、H2S试验、碳源利用试验、H2O2酶试验、甲基红试验、吲哚试验、V-P试验生理生化鉴定试验的方法参考文献[11-12，19-22]。1.8分子生物学鉴定将PCR扩增后得到的16S rDNA序列片段放入BLAST中进行同源性对比，将同源性高的序列用MEGA6构建系统进化树[23]。1.9抑菌活性物质的稳定性[11-12,24]1.9.1活性物质的热稳定性取5 mL备用的上清液置于10 mL的EP管中，依次在30、40、50、60、70、80、90、100 ℃的8个不同条件下受热2 h，反应后冷却至常温，测定其对白色念珠菌的抑菌作用[25]，分别做3个平行试验。1.9.2活性物质的储藏稳定性取5 mL备用的上清液置于10 mL的EP管中，依次在温度为-20、4、25 ℃的条件下储藏2 d，测定抑菌活性与储藏温度的关系，分别做3个平行试验。1.9.3活性物质的pH值稳定性取5 mL备用的上清液置于10 mL的EP管中，用1 mol/L的HCl溶液和NaOH溶液依次从pH值3~11调节发酵液的酸碱值，常温下经过2 h，全部调节pH值至7，测定发酵上清液对白色念珠菌的抑菌效果，分别做3个平行试验。1.9.4活性物质的紫外稳定性取5 mL备用的上清液置于10 mL的EP管中，紫外灯下依次从1~8 h进行照射后，测定其上清液对白色念珠菌的抑菌效果，分别做3个平行试验。1.9.5活性物质的萃取取20 mL的乙酸乙酯、氯仿、石油醚、正丁醇、苯试剂分别放入分液漏斗，另取5份20 mL备用的上清液，分别加入漏斗中，振荡后静置，分层，测定两相液体对白色念珠菌的抑菌效果，分别做3个平行试验。1.10菌株发酵营养条件优化在基础发酵培养基和初始发酵条件的基础上，对碳源和氮源进行进一步优化。1.10.1不同碳源对菌株发酵液产抗生素的影响分别使用相同添加量的蔗糖、玉米粉、淀粉替换掉原培养基中的葡萄糖作为碳源，发酵后获得离心发酵液并测定抑菌圈大小。1.10.2不同氮源对菌株发酵液产抗生素的影响分别使用相同添加量的牛肉膏、酵母粉、黄豆粉、硫酸铵等作为氮源，对比发酵液抑菌圈的大小。1.10.3正交设计在1.10.1和1.10.2试验基础上设计正交试验研究最佳发酵条件组合。2结果与分析2.1菌株的筛选结果不同地区共采集到9份土样，经过分离纯化得到2株菌，分别命名为：LK3、LP10。两种菌株的形态特征见图1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.016.F001图1两种菌株的形态特征注：箭头所指为菌落形态。2.2不同菌株发酵液对白色念珠菌的抑制作用（见图2）由图2可知，LP10的发酵液对白色念珠菌指示菌具有最强的拮抗效果，抑菌圈直径为28.55 mm；LK3发酵液产生的拮抗效果比LP10较差，抑菌圈直径为21.92 mm。因此，本试验采用抑菌效果较好的LP10菌株进行试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.016.F002图2不同菌株发酵液对白色念珠菌的抑制作用注：A为发酵液，B为抑菌圈。2.3LP10对不同病原指示菌的抑菌作用（见图3）利用牛津杯法对抑菌活性较强的LP10菌株进行抑菌研究。由图3可知，LP10菌株的发酵上清液对厚垣镰孢霉生成的抑菌圈直径为24.80 mm，效果较好，对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌也有抑菌作用，抑菌直径分别为15.74 mm和19.34 mm，对大肠杆菌不具有抑菌作用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.016.F003图3LP10对不同病原指示菌的抑菌作用注：A为LP10含菌发酵液，B为抑菌圈2.4目的菌的鉴定结果2.4.1菌落形态特征鉴别LP10的菌落圆状微隆起、白色、光滑、较黏。2.4.2LP10显微镜形态鉴别（见图4）由图4可知，LP10菌株经革兰氏染色后显现为红色，为革兰氏阴性菌，LP10菌株细小且长短不一，形状为短杆状，菌落形态较密集，有少量游离的芽孢形态。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.016.F004图4LP10显微镜观察形态2.4.3LP10菌株在不同培养基上的生长状况（见表1）将LP10菌株分别接种在6种观察培养基中。由表1可知，LP10菌株在PDA、葡萄糖-酵母膏、高氏一号、查氏培养基上生长较好。在克氏一号合成培养基和淀粉琼脂培养基上生长一般。LP10菌株在6种培养基均可生长，颜色分别为白色或淡黄色，在高氏一号、PDA培养基中有白色的可溶性色素产生。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.016.T001表1LP10菌株在不同培养基上的生长状况培养基种类生菌丝体颜色基内菌丝颜色可溶性色素颜色生长状况PDA培养基白白白＋＋葡萄糖-酵母膏培养基淡黄淡黄-＋＋克氏一号合成培养基白白-＋高氏一号培养基白白白＋＋查氏培养基白白-＋＋淀粉琼脂培养基白白-＋注：“＋＋”表示生长良好，“＋”表示生长一般，“-”表示透明。2.5LP10菌株的生理生化特性（见表2）由表2可知，LP10菌株能够使明胶液化，牛奶发生胨化，不能使淀粉水解。吲哚、甲基红、H2O2、N源利用（1%的葡萄糖、可溶性淀粉、柠檬酸三钠、酒石酸钾钠、麦芽糖）试验均显示为阳性；V-P、纤维素分解、H2S等试验现象均显示为阴性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.016.T002表2LP10菌株的生理生化特性试验项目试验结果试验项目试验结果V-P甲基红吲哚H2SH2O2-＋＋-＋明胶液化牛奶凝固牛奶胨化N源利用淀粉水解纤维素分解＋-＋＋--注：“-”表示阴性或不能利用；“+”表示阳性或能够利用。2.6LP10菌株的分子生物学鉴定2.6.116S rDNA的扩增和测序结果PCR产物分子量电泳结果见图5。以LP10的基因组总DNA为模板，利用通用引物进行PCR扩增，得到约1 000 bp的基因片段。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.016.F005图5PCR产物分子量电泳结果注：M为Marker DL2 000，1为16S rDNA PCR产物。2.6.2LP10菌株的系统发育树（见图6）由图6可知，LP10菌株和陶氏芽孢杆菌（Bacillus thaonhiensis NHI-38）在进化树同一分支上，相似性达98%，说明LP10与陶氏芽孢杆菌分类地位很接近，亲缘关系很近。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.016.F006图6LP10菌株的系统发育树根据形态、培养、生理生化特征鉴定，推断LP10为陶氏芽孢杆菌（B. thaonhiensis）。2.7发酵液抑菌活性的稳定性2.7.1温度对抑菌活性的影响（见图7）由图7可知，抑菌活性在30 °C时产生的作用最强，其次为70 °C和90 °C。随着温度的上升，发酵液在不同温度下分别处理2 h后，抑菌活性会随着温度的改变而发生上升或下降的变化。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.016.F007图7温度对抑菌活性的影响2.7.2储藏温度对抑菌活性的影响（见图8）由图8可知，将发酵液25 ℃存放2 d后，抑菌效果最好。因此，选择25 ℃为最佳储藏温度。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.016.F008图 8储藏温度对抑菌活性的影响2.7.3pH值对抑菌活性的影响（见图9）由图9可知，在pH值为8的条件下产生的抑菌作用最高，pH值为5~6时次之。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.016.F009图9pH值对抑菌活性的影响2.7.4紫外照射时间对抑菌活性的影响（见图10）由图10可知，紫外照射后在4 h的抑菌效果最差，之后呈现大幅度的上升趋势，6 h活性最强。随着照射时间的增加，抑菌活性有轻微的下降趋势。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.016.F010图10紫外照射时间对抑菌活性的影响2.7.5抑菌活性的萃取稳定性5种萃取剂对抑菌活性的影响见表3。由表3可知，苯萃取有机相中抑菌活性物质明显高于其他有机溶剂，该抑菌活性物质在苯溶剂中溶解度大，苯对该抗生素具有较好的萃取效果。溶剂极性越大，萃取效果越差，因此说明活性物质是水溶性物质。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.016.T003表35种萃取剂对抑菌活性的影响萃取剂萃取液抑菌圈直径萃余液抑菌圈直径石油醚028.13苯31.250氯仿029.17乙酸乙酯25.920正丁醇12.6511.46mm2.8LP10菌株发酵条件优化结果2.8.1碳源对LP10菌株发酵产抗生素的影响（见图11）由图11可知，在含有葡萄糖作为碳源的发酵培养基中，LP10菌株发酵液产生的抑菌圈直径29.95 mm，玉米粉为21.46 mm。因此，正交试验选用葡萄糖作为发酵碳源。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.016.F011图11碳源对LP10菌株发酵产抗生素的影响2.8.2氮源对LP10菌株发酵产抗生素的影响（见图12）由图12可知，在含有黄豆粉的发酵培养基中，抑菌圈为23.66 mm。因此，黄豆粉发酵液的抑菌效果最好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.016.F012图12氮源对LP10菌株发酵产抗生素的影响2.8.3正交试验优化结果在单因素试验基础上设计正交试验，研究碳源、氮源、发酵时间最优化发酵组合，分析确定各因素的最优水平，研究最优发酵组合。正交试验因素水平见表4，正交试验结果和方差分析见表5、表6。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.016.T004表4L9（34）试验因素水平对照表水平A葡萄糖/%B黄豆粉/%C发酵时间/h11172222843339610.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.016.T005表5正交试验结果项目ABCD（空列）抑菌直径/mm1111116.242122226.983133327.764212325.355223130.216231220.517313225.948321321.359332123.48k123.66022.51019.36723.310k225.35726.18025.27024.477k323.59023.91727.97024.820R值1.7673.6708.6031.51010.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.016.T006表6正交试验结果方差分析因素偏差平方和自由度F值显著性葡萄糖6.00521.597黄豆粉20.57025.472发酵时间116.157230.901*误差3.7602注：1.*表示差异显著（P0.05）。2.F（0.05）=19。由表5可知，极差R值的大小为CBA，即对发酵液的抗菌活性的影响大小为：发酵时间黄豆粉葡萄糖。最优组合为A2B2C3。初步确定该基本发酵培养基的最优组合为葡萄糖2.0%、黄豆粉2.0%、氯化钠0.25%、碳酸钙0.2%、pH值7.2、发酵时间96 h。在此最优发酵条件下，发酵液上清液抑菌圈直径可达30.21 mm。由表6可知，试验设计的3个因素中，发酵时间对抑菌圈的影响显著，与表5的结果一致。3结论发酵液在pH值为8、紫外照射时间6 h、储藏温度25 ℃的条件下产生的抗生素为最高。加热至70 ℃时产生的抗性最理想，发酵液在90 ℃以下较稳定，选择苯作为后续分离纯化的萃取剂。采用单因素变量与正交试验方法，得到LP10菌株最适营养条件为：葡萄糖2%、黄豆粉2%、氯化钠0.25%、碳酸钙0.2%、pH值7.2、28 ℃培养96 h。本试验从土壤中采样筛选获取具有抗菌活性的高拮抗菌株，完成菌种鉴定及性质初步研究，初步研究优化培养条件提高农用抗生素的产量。未来，可以进一步开展发酵条件优化，菌种改良，以提高菌种产抗生素的能力，提高菌种灭菌能力，得到新型、高抗、安全的农用抗生素。