植物提取物添加到饲料中可以增强家畜的肠道免疫功能，改善肠道的健康，促进消化酶分泌，预防畜禽疾病。植物提取物还能够提高肌肉中的肌苷酸、甜味和鲜味氨基酸含量，改善肌肉品质，提高禽畜肉的食用价值[1]。因此，植物提取物作为饲料添加剂具有营养和药用双重使用价值[2]。黄酮具有促进动物生长、调节和提高家畜机体免疫力、增加机体抗菌活性等功能，在畜禽养殖行业具有广阔的应用前景[3]。甘檬柽柳的花、叶、茎、枝中主要含有黄酮苷、黄酮苷元以及硫酯化黄酮[4-6]，民间常用其柽柳的树叶、嫩枝、花作为粗饲料。柽柳富含的黄酮、多元酚、蛋白质等有效成分用于饲料中，可以提高畜禽生长速度、肌肉密度，改善肉质口感[7-9]。利用柽柳修剪的枝、叶、花作原料提取黄酮，添加在禽畜的饲料中，能够增强禽畜免疫力，提高抗病性和抗炎性。超声波法提取黄酮相对于回流提取法、煎煮法、超临界提取法，具有操作简便、快捷、提取效率高的优点。试验采用超声波提取法提取柽柳中总黄酮，优化黄酮提取工艺，研究其抗氧化性活性，为柽柳作为饲料添加剂在畜禽养殖行业的应用和开发提供参考。1材料与方法1.1材料与试剂甘檬柽柳样品，2019年10月采自青海省同德县巴沟乡原始甘檬柽柳林，经中国科学院林业研究所鉴定，为甘檬柽柳。取叶、嫩枝，阴干，粉碎，过60目筛。槲皮素购自天津一方科技有限公司；石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、石油醚、乙酸乙酯、AlCl3·6H2O、HCl、NaOH等均为分析纯，购自天津天力化工学试剂有限公司。1.2仪器设备AR2140电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）、RE-522AA旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）、SG2200HE超声波（上海冠特超声仪器有限公司）、UV-1800紫外可见分光光度计（日本岛津）、SHB-3T循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸易有限公司）、DGX-9073B-1电热恒温恒热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）、高速台式冷冻离心机KL05A（凯特实验仪器有限公司）、电热恒温水浴锅DK-S26（常州恒隆仪器有限公司）。1.3试验方法1.3.1黄酮提取工艺（见图1）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.019.F001图1黄酮提取工艺流程称取干燥的柽柳枝叶，粉碎，过60目筛。置于三角瓶中，按照设计加入不同比例乙醇，超声提取，过滤，将提取液于100 mL容量瓶中定容，使用0.22 μm超滤膜过滤，取滤液使用UV测定吸光度，按照槲皮素的标准得曲线方程，计算样品的黄酮提取率。1.3.2标准曲线的绘制精确称取槲皮素对照品10 mg，置于100 mL容量瓶中，加95%的乙醇溶解稀释至刻度，配制浓度为0.1 g/L的槲皮素对照品溶液，称AlCl3·6H2O固体2.005 9 g，使用95%的乙醇溶解，加3%的盐酸4~5 mL，置于100 mL的容量瓶中使用95%乙醇定容。移取0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL的槲皮素标准溶液，置于10 mL的容量瓶中，加显色剂5.2、5.0、4.8、4.6、4.4 mL摇匀，做阴性对照，显色20 min。波长427 nm处测吸光度。以芦丁吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程Y=11.9363X-0.140 9，r=0.989 741。1.3.3黄酮含量的测定取干燥柽柳枝叶2 g，粉碎，过60目筛，置于三角瓶中，100 W、50%乙醇、40 ℃、30 min条件下，进行2次超声提取，置于50 mL容量瓶中定容，0.22 μm超滤膜滤过，按照1.3.2的方法测定吸光度，带入回归方程，按照黄酮得率公式计算样品的黄酮得率。甘檬柽柳黄酮得率(mg/g)=CVn/m(1)式中：C为样品中黄酮的浓度（g/L）；V为样品提取液的体积（mL）；n为样品提取液的稀释倍数；m为柽柳样品干粉的质量（g）。1.3.4柽柳黄酮类化合物提取工艺优化1.3.4.1单因素试验准确称取柽柳干粉6份，在乙醇50%、固液比1∶15、功率100 W、超声温度40 ℃、超声时间30 min、超声2次，考察乙醇浓度（40%~80%）、提取温度（30~70 ℃）、循环次数（1~6次）和提取时间（20~60 min）对柽柳总黄酮得率的影响。1.3.4.2正交试验通过单因素试验，确定影响柽柳黄酮化合物得率的主要因素和各因素参数范围，选择对得率影响较大的乙醇浓度、提取温度、提取次数和提取时间4个因素设计正交试验L9（34）。相同试验做2个重复。正交试验因素水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.019.T001表1正交试验因素水平水平A乙醇浓度/%B提取温度/℃C提取时间/minD提取次数/次1504030226050403370605041.3.5抗氧化活性试验取上述优化条件下提取的柽柳黄酮，减压浓缩成稠膏，使用浓度为40%的乙醇溶解并稀释，得质量浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8 g/L的黄酮溶液，使用相应浓度的VC做对照试验。1.3.5.1黄酮总还原力的测定取0.2 mol/L的磷酸盐缓冲溶液0.2 mL，1%的铁氰化钾2.5 mL，加入待测0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g/L样品溶液，50 ℃恒温放置20 min，加入浓度为10%的三氯乙酸2.5 mL，2 000 r/min离心10 min，取上清液1 mL，加入1 mL的0.1% FeCl3和4 mL蒸馏水振摇，静置10 min，于700 nm处测吸光度。1.3.5.2清除DPPH·能力的测定取不同浓度提取液1 mL，取0.4 mL的DPPH-乙醇溶液3 mL，试管中暗置30 min，使用无水乙醇做对照品试验。在517 nm处测吸光度，并计算清除率。1.3.5.3清除OH·能力的测定试管中取2 mmol/L FeSO4溶液5 mL，加入6 mmol/L H2O2溶液5 mL、6 mmol/L水杨酸-乙醇溶液15 mL，摇匀。37 ℃水浴恒温15 min，以蒸馏水做对照，于517 nm处测吸光度，计算清除率。清除率=(A0-A1)/A0×100%(2)式中：A0为空白对照液的吸光度；A1为样品溶液的吸光度。2结果与分析2.1单因素试验2.1.1乙醇浓度对黄酮得率的影响（见图2）由图2可知，乙醇浓度为60%时总黄酮得率最高，当乙醇浓度超过60%时，得率下降。因此，乙醇浓度60%为柽柳黄酮提取的最佳浓度。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.019.F002图2乙醇浓度对黄酮得率的影响2.1.2提取温度对黄酮得率的影响（见图3）由图3可知，30~50 ℃时，黄酮得率随提取温度升高而提高；当温度达到50 ℃时，黄酮得率达到峰值。温度超过50 ℃时，黄酮浓度迅速下降，考虑乙醇的挥发性，以50 ℃为柽柳黄酮提取的最佳温度。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.019.F003图3提取温度对黄酮得率的影响2.1.3提取时间对黄酮得率的影响（见图4）由图4可知，10~40 min时，黄酮得率随着提取时间的增加而增加；当达到40 min时，黄酮得率最高。时间继续增加时，黄酮浓度开始下降。因此，以40 min为柽柳黄酮提取的最佳时间。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.019.F004图4提取温度对黄酮得率的影响2.1.4提取次数对黄酮得率的影响（见图5）由图5可知，提取次数为1~3次时，黄酮得率随着提取次数增加而增加；提取3次时黄酮得率最高；提取超过4次时，黄酮浓度开始下降。因此，以3次为柽柳黄酮提取的最佳提取次数。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.019.F005图5提取次数对黄酮得率的影响2.2正交试验结果（见表2、表3）由表2可知，柽柳黄酮提取时，各因素的影响顺序为ABDC，即提取乙醇浓度提取温度提取次数提取时间。最佳提取工艺为A2B1C2D1，即乙醇浓度60%、提取温度40 ℃、提取时间40 min、提取次数为2次。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.019.T002表2正交试验结果项目A乙醇浓度/%B提取温度/℃C提取时间/minD提取次数/次黄酮得率/(mg/g)1111131.7252122229.3243133326.4314212337.8455223134.2536231229.3217313228.9418321329.3879332128.724k129.16032.83730.14431.567k233.80630.98831.96329.195k329.01728.15929.87531.221R4.7894.6782.0882.372最佳条件A2B1C2D1主次关系ABDC由表3可知，A、B因素对黄酮得率具有极显著影响，C、D因素对黄酮得率具有显著影响。各因素对黄酮提取的影响程度为乙醇浓度提取温度提取次数提取时间），与表2的结果一致。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.019.T003表3方差分析结果方差来源平方和自由度方差F值显著性A乙醇浓度89.087244.54334.520**B提取温度66.621233.31125.815**C提取时间15.50027.7506.006*D提取次数19.69929.8507.633*误差11.61391.290总和202.52117注：F0.05=4.26，F0.01=8.02。在优选条件下，做3次平行试验，结果见表4。由表4可知，柽柳枝叶总黄酮的得率为38.727 mg/g。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.019.T004表4验证试验结果项目123平均黄酮得率39.17338.32238.68638.727mg/g2.3柽柳的抗氧化试验2.3.1柽柳黄酮总还原能力（见图6）由图6可知，柽柳黄酮总还原能力随黄酮浓度的增加而提高，但是低于同浓度VC的还原能力。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.019.F006图6柽柳黄酮总还原能力2.3.2柽柳黄酮对DPPH·的清除作用（见图7）由图7可知，柽柳黄酮对DPPH·的清除能力随着黄酮浓度的增加有所提高，但总能力低于VC。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.019.F007图7柽柳黄酮对DPPH·的清除作用2.3.3柽柳黄酮对OH·自由基的清除能力（见图8）由图8可知，在一定的浓度范围内，柽柳黄酮对OH·有一定的清除作用，清除能力随着黄酮浓度的增加而增强，且高于VC的清除能力10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.019.F008图8柽柳黄酮对OH·的清除作用3讨论古丽巴哈尔等[10]对同属长穗柽柳采用40%乙醇，在80 ℃条件下回流提取1 h，长穗柽柳总黄酮得率为1.68%。说明采用回流法，40%的溶剂，柽柳的极性较大，柽柳中极性较小的黄酮类成分未被提取出来，或者黄酮及其苷元类受热分解，导致总黄酮的得率较低。李佳等[11]对同属短毛柽柳采用45%乙醇，在50 ℃条件下超声40 min，提取3次，总黄酮得率为33.675 mg/g。本试验在60%乙醇、40 ℃、超声40 min、提取2次的条件下，总黄酮得率为38.727 mg/g，高于同属的长穗柽柳和短毛柽柳。因此，使用超声波法提取柽柳黄酮时，提取时间、次数相同，温度降低，乙醇浓度提高，黄酮的提取得率有较大的提高。原因是乙醇易挥发，当提取温度较高时，乙醇的挥发量增加，用于提取柽柳黄酮的液态乙醇量减少，即提取的溶剂量减少，溶质的溶解度降低。因此，用超声提取法可以提高柽柳中总黄酮的得率。使用乙醇作提取溶剂，提取温度不可太高，以免降低得率。抗氧化试验表明，柽柳黄酮对OH·的清除能力强于VC，对比较稳定的自由基DPPH·的清除能力较弱。赵磊等[12]研究表明，多元酚类物质抗氧性较强。多元酚类因分子中含多个酚羟基，其亲水性较强。本试验采用60%乙醇，其极性较低，对极性大且易溶于水的黄酮类成分提取不完全，可能会影响柽柳黄酮的抗氧化性。崔颖等[13]研究显示，柽柳中有4种查耳酮类黄酮和3类黄烷酮，查耳酮类黄酮分子结构的平面性较强、分子间的排列较为紧密、极性小，易溶于高浓度乙醇中。本试验用60%的乙醇，非高浓度乙醇，可提取亲脂性苷和苷元。因此，所提取的总黄酮中，查耳酮类及黄烷酮类含量较低，也可能导致柽柳黄酮的抗氧性较低。因此，柽柳黄酮提取溶剂的浓度与抗氧化性的关系有待进一步研究。在动物饲料添加柽柳黄酮的提取物质，能够增强动物自身的代谢功能，减少抗生素的应用，促进禽畜的发育和生长，提高禽畜自身的免疫活性，增强抗病能力[14]。柽柳黄酮含量高、提取方法简便，在兽药和饲料添加剂方面具有广阔的应用前景[15-17]。4结论在超声功率100 W、60%乙醇、40 ℃、超声40 min、循环3次条件下，野生甘蒙柽柳枝叶中总黄酮平均得率为38.727 mg/g，对DPPH·和OH·具有较好的清除能力。