无花果是桑科，榕属植物，树叶浓绿、厚大，每年在无花果采摘后均需要修枝，产生大量的无花果树叶，资源丰富。无花果树叶中含有丰富的黄酮[1-2]、多糖[3-4]等化合物。植物多糖具有增强肠道蠕动、抑制肿瘤等多重生理功效[5-7]，无花果树叶多糖对提高动物免疫功能具有明显作用[8-10]，提取无花果树叶多糖作为功能饲料、食品等添加剂具有重要意义。微波在提取植物有效成分上被广泛使用[11-13]，与传统的加热回流提取相比具有提取速率快、产品得率高等优点。本研究利用微波提取无花果树叶多糖类物质，通过单因素试验和响应面试验优化提取工艺，为开发利用无花果树叶多糖作为功能饲料、食品添加剂等提供参考。1材料与方法1.1试验材料与仪器新鲜无花果树叶采自四川威远。无水乙醇、无水葡萄糖、苯酚、浓硫酸均为分析纯。FW200高速万能粉碎机（北京成萌伟业科技有限公司）、CP2202S电子分析天平（北京赛多利斯仪器公司）、UWave-1000微波·紫外·超声波三位一体合成萃取反应仪（上海新仪微波化学科技有限公司）、TGL-10C高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）、752紫外-可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）。1.2试验方法1.2.1原料预处理新鲜无花果树叶清洗干净，60 ℃烘干至恒重，高速粉碎机粉碎。无花果树叶粉末标准筛过筛，取粒径0.30~0.45 mm的粉末置于干燥器，备用。1.2.2无花果树叶多糖提取取3.0 g无花果树叶粉末置于圆底烧瓶中，加入蒸馏水，室温（25 ℃）浸泡20 min，微波法提取，冷却至室温，4 500 r/min离心5 min。将上清液使用蒸馏水定容，得多糖含量待测液。在最优工艺条件下提取，离心后将上清液转移至烧杯中，加入等体积无水乙醇，过滤，无水乙醇反复清洗沉淀，转移至蒸发皿中，70 ℃烘干至恒重，得多糖粉末。取10 mg粉末，蒸馏水溶解配置成50 mL溶液，测定多糖含量，计算纯度。1.2.3无花果树叶多糖含量测定以葡萄糖为标准品，参考文献[14-15]的方法以吸光度（y）为纵坐标，葡萄糖质量浓度（x，g/L）为横坐标绘制标准曲线，葡萄糖标准曲线见图1。曲线的回归方程为y=58.352x-0.046 5，R=0.999 8。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.018.F001图1葡萄糖标准曲线将待测液稀释到合适体积，取1 mL待测液按上述方法测定其吸光度，按标准曲线换算多糖含量，计算无花果树叶多糖得率及粗多糖纯度。多糖得率=m1/m2×100%(1)粗多糖纯度=W1/W2×100%(2)式中：m1为多糖测得量（g）；m2为无花果树叶粉末的质量（g）；W1为粗多糖粉末中多糖测得量（g）；W2为无花果树叶粗多糖粉末的质量（g）。1.2.4工艺优化试验设计（1）单因素试验。固定微波功率400 W、提取时间3 min，测定液料比分别为10、20、30、40、50 mL/g的多糖得率；固定液料比20 mL/g、提取时间3 min，测定微波功率分别为100、200、300、400、500 W的多糖得率；固定液料比20 mL/g、微波功率400 W，测定提取时间分别为1、2、3、4、5 min的多糖得率。（2）响应面试验。在单因素试验初步确定的最优试验条件附近，运用Design Expert 7.0.0软件，采用Box-Behnken Design设计试验方案，进一步优化提取工艺条件。响应面试验因素与水平设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.018.T001表1响应面试验因素与水平设计水平A液料比/(mL/g)B微波功率/WC提取时间/min-1252002030300313540042结果与分析2.1单因素试验2.1.1液料比对无花果树叶多糖得率的影响（见图2）由图2可知，液料比低于30 mL/g时，无花果树叶多糖得率随液料比的增大而增大，可能因为无花果树叶多糖易溶于水，液料比大有利于无花果树叶多糖的溶出。液料比为30 mL/g时，无花果树叶多糖得率达9.56%，此后无花果树叶多糖得率变化较小且略有下降，可能因为液料比过大影响物料对微波能的吸收。因此，确定最佳液料比约为30 mL/g。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.018.F002图2液料比对无花果树叶多糖得率的影响2.1.2微波功率对无花果树叶多糖得率的影响（见图3）由图3可知，微波功率低于300 W时，无花果树叶多糖得率随微波功率增大而增大，可能因为随着微波功率的增大，反应加剧，促使物料组织破裂，加快多糖溶出。微波功率为300 W时，无花果树叶多糖得率达到最大值9.28%，此后无花果树叶多糖得率随微波功率增大而下降，可能因为反应过于剧烈，部分多糖类物质在高温下遭到破坏。因此，确定最佳微波功率约为300 W。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.018.F003图3微波功率对无花果树叶多糖得率的影响2.1.3提取时间对无花果树叶多糖得率的影响（见图4）由图4可知，提取时间为3 min时，无花果树叶多糖得率达到最大值7.35%，之后略有下降。3 min时无花果树叶多糖扩散已达到平衡，继续延长时间使得多糖类物质在微波下暴露时间过长，反应体系温度过高导致部分多糖类物质遭到破坏。因此，确定最佳提取时间约为3 min。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.018.F004图4提取时间对无花果树叶多糖得率的影响2.2响应面优化试验通过Box-Behnken Design共产生17组试验，响应面试验设计及结果见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.018.T002表2响应面试验设计及结果试验号ABC无花果树叶多糖得率/%100011.3621109.46300011.26401-17.885-1108.56610-18.32700011.3080-1-18.21900011.28100-119.12111-109.5212-1-109.211300011.38140119.2815-10-18.28161019.4417-1019.38将液料比（A）、微波功率（B）、提取时间（C）水平编码作为自变量，无花果树叶多糖得率（Y）作为因变量，建立二次多项式方程：Y=11.32+0.16A-0.11B+0.57C+0.15AB+0.005AC+0.12×BC-0.095A2-1.180 5B2-1.51C2。R2=0.991 8，模型拟合效果良好，方差分析结果见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.018.T003表3方差分析结果因素平方和自由度均方F值P值显著性模型24.470 092.720 094.130 00.000 1***A0.210 010.210 07.430 00.003 0*B0.097 010.097 03.350 00.109 8C2.570 012.570 088.800 00.000 1***AB0.087 010.087 03.010 00.126 2AC0.000 110.000 10.003 50.954 7BC0.060 010.060 02.080 00.192 6A23.780 013.780 0131.000 00.000 1***B25.870 015.870 0203.140 00.000 1***C29.640 019.640 0333.690 00.000 1***误差0.200 070.029 0失拟0.190 030.064 02.382 00.165 2纯误差0.011 040.002 7总和24.670 016注：*表示影响显著（P0.01），**表示影响极显著（P0.001），***表示影响高度显著（P0.000 1）。由表3可知，模型是高度显著的，可以用于微波对无花果树叶多糖提取过程的分析。一次项液料比（A）对无花果树叶多糖得率影响显著，提取时间（C）对无花果树叶多糖得率影响高度显著，表明这两个因素在试验过程中要严格控制。二次项A2、B2、C2对无花果树叶多糖得率影响高度显著。二次项AB、AC、BC对无花果树叶多糖得率影响均不显著，说明这3个因素之间交互作用不强。液料比与微波功率对无花果树叶多糖提取率的影响见图5，液料比与提取时间对无花果树叶多糖提取率的影响见图6，微波功率与提取时间对无花果树叶多糖提取率的影响见图7。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.018.F005图5液料比与微波功率对无花果树叶多糖提取率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.018.F006图6液料比与提取时间对无花果树叶多糖提取率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.018.F007图7微波功率与提取时间对无花果树叶多糖提取率的影响由图5~图7可知，响应面等高线性状较为相似，都往同一方向弯曲，且具有较强共圆心的趋势，说明各因素之间的交互作用（AB、AC、BC）弱，与表3的结果一致。2.3最优工艺条件的确定与验证由响应面试验方程得微波提取无花果树叶多糖的最优工艺条件为液料比30.42 mL/g、微波功率296.85 W、提取时间为3.19 min，在此条件下，无花果树叶多糖得率的预测值为11.38%。为处理方便，将上述条件修正为液料比30 mL/g、微波功率300 W、提取时间3 min，此条件与表2中1、3、7、9、13号试验条件是一致的，这5组试验的结果分别为11.36%、11.26%、11.30%、11.28%、11.38%，平均值为11.32%，与模型预测值11.38%接近，说明最优工艺可行。最优条件下提取无花果树叶多糖，按1.2.2方法处理后得粗多糖粉末，经测定纯度达56.4%。3结论通过单因素试验和响应面试验，得到微波提取无花果树叶多糖的最优工艺，即液料比30 mL/g、微波功率300 W、提取时间3 min，此条件下无花果树叶多糖得率可达11.32%，试验重现性好。最优条件下提取的无花果树叶粗多糖纯度可达56.4%。无花果树叶资源丰富，微波法操作简单、多糖得率高、提取过程无有毒有害化学物质，可以为开发利用无花果树叶多糖作为功能饲料、食品等添加剂提供一定的参考。