青海现有藏羊1 200多万只，约占我国藏羊存栏总数的40%。藏羊长期生活在海拔4 000 m以上的青藏高原及其毗邻地区，对严寒、缺氧和牧草匮乏等恶劣的气候条件具有较强的适应能力[1-2]，是发展高原畜牧业的重要种质资源[3]。生活在高海拔地区动物为了适应极端恶劣气候，肺部结构发生明显变化[4]。魏青等[5]指出，高原牦牛肺泡结构表现出一些不同于平原黄牛肺泡结构的特点，是牦牛适应高原低氧环境的良好组织学基础。白玛央宗等[6]研究发现，藏猪能够适应高原低氧环境的形态学特点是肌性肺血管丰富、肺动脉管壁厚、管径小。贾荣莉[7]研究表明，藏羊与平原地区小尾寒羊的单位面积中肺泡数量和肺泡中毛细血管的充盈程度均有差异。高原土著动物适应性的进化主要与其肺形态发育紧密相关。因此，研究藏羊的低氧适应机制对推动高原畜牧业的发展具有重要意义，可以为高原疾病的治疗提供新思路。目前，对日粮精粗比的研究主要集中在藏羊生长发育[8]、血清生化[9]、屠宰性能及肉品质[10]等方面，而关于日粮精粗比对肺组织形态发育的影响尚未报道。本试验从肺脏形态发育和抗氧化能力方面分析藏羊对低氧环境的适应能力，为探究反刍动物低氧适应的机制提供参考。1材料与方法1.1试验设计试验在青海省共和县香咔梅朵牧业有限公司进行。选取90只3月龄体重（22.00±0.38）kg、体况良好的藏羊母羔，随机分为3组，每组5个重复，每个重复6只藏羊。分别饲喂70%精料+30%粗料（C70组）、60%精料+40%粗料（C60组）和50%精料+50%粗料（C50组）的全混合日粮。预试期10 d，正式试验期90 d。日粮设计参考《肉羊饲养标准》（NY/T 816—2004[11]）进行配制。日粮精饲料组成及营养水平见表1。粗饲料由燕麦青干草与燕麦青贮组成（按干物质1∶1计）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.002.T001表1日粮精饲料组成及营养水平（干物质基础）原料组成含量/%营养水平合计100.00玉米65.20消化能/(MJ/kg)13.00豆粕5.00粗蛋白质/%16.40菜籽粕16.00粗脂肪/%3.81棉粕7.00粗纤维/%4.61食盐0.80钙/%0.57石粉0.80有效磷/%0.10小苏打0.10赖氨酸/%0.71磷酸氢钙0.50蛋氨酸/%0.27预混料4.60注：1.预混料为每千克日粮提供：VA 7 200 IU、VB1 0.3 mg、VB2 4.2 mg、VB5 47 mg、VB6 0.12 mg、VB12 0.06 mg、VD3 2 060 IU、VE 11 IU、VK3 0.05 mg。2.营养水平中消化能为计算值，其余均为实测值。1.2饲养管理及样品采集饲养前，各组藏羊统一驱虫和消毒。单栏圈养，精料与燕麦青干草、燕麦青贮混匀搅拌，每天在8：00和17：30饲喂2次，自由采食和饮水，其他饲养管理按照羊场的规定进行。试验结束最后1 d，每组随机选取3只试验羊进行屠宰（宰前禁食24 h、禁水12 h），取2份右侧肺脏组织。其中，1份使用生理盐水冲洗干净，放入4%多聚甲醛；另1份置于液氮中保存待测。1.3测定指标及方法1.3.1肺脏组织学切片制作与分析制作组织学切片，4%多聚甲醛固定72 h→流水冲洗约30 min→由低到高浓度酒精脱水→二甲苯透明→浸蜡包埋→切片（约7 μm）→二甲苯脱蜡→苏木精-伊红（HE）染色→中性树胶封片→显微镜下观察。应用Image-Pro Plus 5.1图像分析系统软件分析肺泡隔厚度、单个肺泡面积、单位面积内肺泡数和血管数量，测量肺动脉末端分支及不同直径细小动脉的管径和中膜厚度，计算中膜厚度/血管直径的百分比。1.3.2肺脏组织抗氧化指标检测将保存在液氮中肺脏样品制成10%组织匀浆液。称取1 g组织样品，加入液氮研磨成粉末，加入0.01 mol/L的磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）（pH值7.2~7.4）9 mL，4 ℃、3 500 r/min离心15 min，收集上清液，测定抗氧化指标。肺脏总抗氧化能力（T-AOC）、丙二醛（MDA）含量以及超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。1.4数据统计与分析采用SPSS 25.0统计软件中单因素方差分析进行数据统计，采用Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1不同精粗比日粮对育成期藏羊肺组织形态学的影响2.1.1藏羊肺组织HE染色结果（见图1）对育成期藏羊肺组织进行HE染色，在显微镜下观察，标尺为50 μm。由图1可知，与C70组和C50组相比，C60组藏羊肺泡隔较厚，单个肺泡面积较小，血管直径较短，中膜较薄。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.002.F001图1藏羊肺组织HE染色结果（×200）2.1.2不同精粗比日粮对育成期藏羊肺泡的影响（见表2）由表2可知，C60组肺泡隔厚度最大，显著高于C70组（P0.05）。C50组和C60组单个肺泡面积显著低于C70组（P0.05）。C60组单位面积肺泡数显著高于其他2组（P0.05）。研究表明，在高原低氧条件下，饲喂精粗比为60∶40的日粮能够加快育成期藏羊气体交换率，增加低氧适应性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.002.T002表2不同精粗比日粮对育成期藏羊肺泡的影响组别肺泡隔厚度/μm单个肺泡面积/μm2单位面积肺泡数/(个/mm2)C70组12.52±0.95b6 376.84±335.23a226.00±8.00cC60组16.09±0.62a4 293.73±347.23b344.67±26.76aC50组15.26±0.65a4 446.06±377.15b291.67±14.64b注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.1.3不同精粗比日粮对育成期藏羊血管的影响（见表3）由表3可知，C60组血管数显著高于C70组（P0.05）。C60组和C50组血管直径、中膜厚度均显著低于C70组（P0.05）。研究表明，在高寒牧区，饲喂精粗比为60∶40的日粮更能够降低肺血管阻力，提高氧气运输能力。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.002.T003表3不同精粗比日粮对育成期藏羊血管的影响组别血管数/(个/mm2)血管直径/μm中膜厚度/μm中膜厚度/血管直径/%C70组61.33±2.52b162.18±2.60a25.75±0.66a15.88±0.66C60组78.67±7.51a125.03±6.74b19.18±1.90b15.34±0.46C50组70.33±3.12ab129.34±5.47b19.90±1.29b15.39±2.002.2不同精粗比日粮对育成期藏羊肺组织抗氧化能力的影响（见表4）由表4可知，C60组T-AOC和CAT活性最高，显著高于C70组（P0.05）。各组SOD、GSH-Px活性和MDA含量差异不显著（P0.05）。研究表明，饲喂精粗比为60∶40的日粮能够增强育成期藏羊肺脏组织抗氧化能力。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.002.T004表4不同精粗比日粮对育成期藏羊肺组织抗氧化能力的影响组别T-AOC/(U/mL)SOD/(U/mL)CAT/(U/mL)GSH-Px/(U/mL)MDA/(μmoL/L)C70组24.69±1.58b200.92±15.0253.99±9.67b517.04±17.5710.65±1.42C60组30.32±2.44a235.45±29.6070.96±2.08a543.62±37.8710.31±2.85C50组28.15±1.13a217.98±30.1869.89±7.19a460.29±43.9410.40±0.853讨论3.1不同精粗比日粮对育成期藏羊肺组织形态学的影响肺是机体气体交换的重要调控中心[12]。高原土著动物已经在生理生化、解剖结构和基因功能等方面获得稳定的适应高原低氧的遗传学特征[13]。不同海拔地区牦牛单位面积内肺泡数量的增多、肺泡隔厚度增加，有利于增大肺的呼吸面积，提高肺组织对氧气的利用效率[13]。对不同发育阶段黄牛进行研究，发现单个肺泡面积变小，单位面积内肺泡数增多，肺泡隔厚度增大，更有利于反刍动物肺部气体交换[14]。肺部血管数、血管直径、中膜厚度和中膜厚度/血管直径均是影响绵羊进行气体交换的重要因素[15]。本试验中，与C70组和C50组相比，C60组藏羊肺组织中肺泡数最多，肺泡隔厚度最大，单个肺泡面积最小，表明饲喂60%精料的日粮，有利于增加藏羊肺的呼吸面积，增强氧气的摄入和扩散能力，在一定程度上能够提高对氧气的利用率。本试验研究发现，C60组肺组织血管直径、中膜厚度、中膜厚度/血管直径低于其他2组，血管数高于其他2组。表明饲喂精粗比为60∶40的日粮时，藏羊肺组织内血液供应较为丰富，能够促进肺组织的气体交换，加速血氧的运输[16]。原因可能为日粮营养物质的缺乏和不平衡均不适合藏羊的营养需要，导致组织、细胞代谢发生异常，从而影响机体的正常生长发育。3.2不同精粗比日粮对育成期藏羊肺组织抗氧化能力的影响机体内自由基的产生与清除处于动态平衡，受到自身或外在因素刺激时，体内会产生过多的活性氧自由基，发生氧化应激反应，从而威胁机体的健康[17]。T-AOC是衡量机体抗氧化能力的综合指标[18]，SOD、CAT和GSH-Px是抗氧化酶系统中重要的抗氧化酶[19]。机体抗氧化能力提高时，T-AOC、CAT、GSH-Px和SOD活性升高，MDA含量下降[20]。本试验中，C60组肺组织中T-AOC、CAT、SOD和GSH-Px活性均高于其他2组，表明饲喂60%精料日粮时，机体清除自由基的能力最高，机体代谢处于较为稳定的状态，此时机体抵抗力最强。在荷斯坦奶牛的研究中发现，饲喂适宜的精粗比日粮，瘤胃内环境最为稳定，机体抗氧化能力最强，与本试验结果基本一致[21]。MDA是脂质氧化损伤程度的重要标志，可以与脂类形成化合物，降低抗氧化酶的活性[22]。本试验中，各组肺组织MDA含量差异不显著，C60组含量最低，表明适宜的精粗比日粮能够在一定程度上降低MDA含量，影响机体抗氧化能力。因此，过高或过低的精料水平的日粮可能降低藏羊清除自由基的能力，影响机体健康和瘤胃内环境的平衡。4结论本试验条件下，不同精粗比日粮对育成期藏羊母羔肺组织形态学和抗氧化能力具有明显的影响，其中精粗比为60∶40的日粮效果较佳。