随着饲料工业迅猛发展，药物饲料添加剂已广泛应用于饲料生产。但是，化学药物添加剂易发生药物残留，造成动物性食品危害。因此，中草药饲料添加剂的开发和利用越来越受到重视，特别是多糖类添加剂已经被广泛应用。大枣多糖（jujube polysaccharides，JP）在饲料添加剂中的研究报道较少。本课题组在1日龄艾维茵肉鸡基础日粮中添加JP，饲喂42 d，发现JP可以通过增强肉鸡的免疫功能来改善肉品质和生长性能[1-2]。本试验探究不同浓度JP对150日龄黄羽肉鸡免疫功能和产蛋性能的影响，为JP在肉鸡饲料添加剂上的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验动物150日龄黄羽肉鸡种鸡母鸡，由锦州医科大学生产经营公司实习农场提供。1.1.2基础日粮基础日粮同王思凝等[1]配方，21~40周龄蛋鸡饲料（编号0296T）由大成农技（葫芦岛）有限公司生产。1.1.3药品及主要试剂JP：纯度≥90%（晨光生物技术有限公司）；鸡的γ干扰素（IFN-γ）、细胞白介素-2（IL-2）和细胞白介素-4（IL-4）试剂盒，逆转录PCR试剂盒和QPCR试剂盒，Trizol、DL 1000DNA Marker、Gelstain和TAE（50×）（Solarbio公司）；鸡外周血淋巴细胞分离液、RPMI-1640培养液、胎牛血清、四甲基偶氮唑盐（MTT）和盐酸左旋咪唑（北京索莱宝科技有限公司）。免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）试剂盒（上海恒远生物科技有限公司）。1.2试验方法1.2.1试验设计与饲养管理试验在锦州医科大学生产经营公司实习农场进行，选择300只150日龄黄羽肉鸡，随机分为5组，分别为阳性对照（PC）组、空白对照（BC）组、1 g/kg JP组、2 g/kg JP组和4 g/kg JP组，每组3个重复，每个重复20只肉鸡。PC组、BC组、1 g/kg JP组、2 g/kg JP组和4 g/kg JP组在基础日粮中分别添加0.1 g/kg盐酸左旋咪唑、0、1、2和4 g/kg JP。黄羽肉鸡笼养，自由采食和饮水，试验期135 d。1.2.2淋巴细胞悬液制备269日龄时，参考Nasrin等[3]试验方法，每组随机抽取5只鸡，翅下静脉采血0.5 mL放入肝素抗凝管，抽取混合的抗凝血2 mL，使用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞。调整细胞浓度为5×106个/mL，参考Majdalawieh等[4]试验方法。1.3测定指标及方法1.3.1MTT法检测淋巴细胞的增殖参考Tae-Hyun等[5]、Zheng等[6]、Yu等[7]试验方法，使用96孔细胞培养板，每组5个复孔，每孔中加入100 μL淋巴细胞悬浮液，加等量完全培养基，CO2培养箱培养44 h，加20 μL MTT，继续培养4 h；1 800 r/min、4 ℃离心10 min，弃上清；加入150 μL DMSO，酶标仪检测570 nm处OD值，计算淋巴细胞刺激指数。淋巴细胞刺激指数=用药组OD值/对照组OD值（1）1.3.2免疫球蛋白含量273日龄时，每组随机抽取5只鸡，翅下静脉采血1 mL，分离血清，使用96孔细胞培养板，每组3个复孔，按照鸡免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）和免疫球蛋白M（IgM）的ELISA检测试剂盒说明书操作。1.3.3细胞因子分泌量280日龄时，参考李贤等[8]、Yu等[9]的试验方法，每组随机抽取5只鸡，每只翅下静脉采血1 mL，分离血清，使用96孔细胞培养板，每组3个复孔，按鸡白细胞介素-2（IL-2）、干扰素-γ（IFN-γ）和白细胞介素-4（IL-4）的ELISA检测试剂盒说明书操作。1.3.4IL-2、IFN-γ和IL-4 mRNA表达量269日龄时，制备血淋巴细胞悬液，按照王思凝等[1]试验方法操作，Trizol法提取血淋巴细胞RNA，RNA逆转录，引物设计与合成，电泳检测，采用2-ΔΔCt方法进行数据分析。1.3.5产蛋性能按照尹典等[10]方法，在228~284日龄，记录总产蛋数量、每枚蛋重、每日采食量计算产蛋率，平均蛋重、平均日采食量和料蛋比。产蛋率=试验期总产蛋数/(蛋鸡数量×试验天数)×100％(1)平均蛋重=总产蛋重量/总产蛋数量(2)平均日采食量=总采食量/试验天数(3)料蛋比=平均日采食量/平均日产蛋量(4)1.4数据统计与分析数据采用统计软件SPSS 17.0进行一维方差分析，结果以“平均值±标准差”表示。P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1JP对黄羽肉鸡血液淋巴细胞增殖的影响（见表1）由表1可知，PC组、1 g/kg JP组、2 g/kg JP组和4 g/kg JP组肉鸡淋巴细胞刺激指数均极显著高于BC组（P0.01）；2 g/kg JP组肉鸡淋巴细胞刺激指数极显著高于1 g/kg JP组（P0.01），显著高于4 g/kg JP组（P0.05）。结果表明，JP能够激活淋巴细胞，刺激其增殖，且2 g/kg JP组效果最佳。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.012.T001表1JP对黄羽肉鸡血液淋巴细胞增殖的影响组别刺激指数BC组1.000 0±0.000 0CcPC组1.388 1±0.118 3ABab1 g/kg JP组1.244 7±0.109 7Bb2 g/kg JP组1.472 2±0.117 4Aa4 g/kg JP组1.327 4±0.102 0ABb注：同列数据肩标不同大写字母表示差异极显著（P0.01），不同小写字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.2JP对黄羽肉鸡血清免疫球蛋白含量的影响（见表2）由表2可知，2 g/kg JP组肉鸡IgA含量极显著高于BC组（P0.01）；PC组和1 g/kg JP组肉鸡IgA含量均显著高于BC组（P0.05）；2 g/kg JP组肉鸡IgA含量极显著高于4 g/kg JP组（P0.01）。2 g/kg JP组肉鸡IgG含量极显著高于BC组、1 g/kg JP组和4 g/kg JP组（P0.01），PC组肉鸡IgG显著高于BC组（P0.05）；2 g/kg JP组肉鸡IgG含量显著高于PC组（P0.05）。PC组、1 g/kg JP组、2 g/kg JP组和4 g/kg JP组肉鸡IgM含量均极显著高于BC组（P0.01）；2 g/kg JP组IgM含量显著高于PC组（P0.05）；2 g/kg JP组IgM含量极显著高于4 g/kg JP组（P0.01）。结果表明，JP能够促进IgA、IgG和IgM的产生，且2 g/kg JP组效果最佳。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.012.T002表2JP对黄羽肉鸡血清免疫球蛋白含量的影响组别IgAIgGIgMBC组2 453.00±299.29Bb3 216.00±361.01Bc682.00±49.51CcPC组3 213.00±282.95ABa4 555.00±548.80ABb903.00±33.01ABb1 g/kg JP组3 340.00±46.80ABa3 959.00±624.36Bbc978.00±74.31ABab2 g/kg JP组3 448.00±151.00Aa5 433.00±557.51Aa1 017.00±60.36Aa4 g/kg JP组2 788.00±256.29Bb3 618.00±166.69Bc843.00±67.06Bbmg/L2.3JP对黄羽肉鸡血清细胞因子分泌量的影响（见表3）由表3可知，PC组、1 g/kg JP组、2 g/kg JP组和4 g/kg JP组肉鸡血清IL-2含量均极显著高于BC组（P0.01）；2 g/kg JP组肉鸡血清IL-2含量显著高于1 g/kg JP组（P0.05）。2 g/kg JP组肉鸡血清IFN-γ含量极显著高于BC组和4 g/kg JP组（P0.01），PC组和1 g/kg JP组肉鸡血清IL-2含量显著高于BC组（P0.05）；2 g/kg JP组显著高于PC组（P0.05）。2 g/kg JP组肉鸡血清IL-4含量极显著高于BC组和4 g/kg JP组（P0.01），PC组、1 g/kg JP组肉鸡血清IL-4和4 g/kg JP组均显著高于BC组（P0.05）；2 g/kg JP组肉鸡血清IL-4显著高于PC组（P0.05）。结果表明，JP能够促进肉鸡血清IL-2、IFN-γ和IL-4分泌，且2 g/kg JP组效果最佳。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.012.T003表3JP对黄羽肉鸡血清细胞因子分泌量的影响组别IL-2IFN-γIL-4BC组54.00±5.51Bc16.00±2.08Bc44.00±6.56BcPC组72.00±3.61Aab22.00±1.00ABb57.00±4.36ABb1 g/kg JP组66.00±4.36Ab23.00±2.08ABab65.00±2.52ABab2 g/kg JP组73.00±1.53Aa26.00±2.08Aa69.00±6.81Aa4 g/kg JP组68.00±1.00Aab20.00±1.53Bc54.00±1.73Bbmg/L2.4JP对黄羽肉鸡血清细胞因子mRNA表达的影响（见表4）由表4可知，PC组、2 g/kg JP组和4 g/kg JP组肉鸡血清IL-2 mRNA表达均极显著高于BC组（P0.01），1 g/kg JP组肉鸡血清IL-2 mRNA显著高于BC组（P0.05）；2 g/kg JP组肉鸡血清IL-2 mRNA极显著高于其他各组（P0.01）。JP对黄羽肉鸡血清IL-2 mRNA表达影响见图1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.012.T004表4JP对黄羽肉鸡血清细胞因子mRNA表达的影响组别IL-2 mRNA表达IFN-γ mRNA表达IL-4 mRNA表达BC组1.00±0.00Cc1.00±0.00Ee1.00±0.00EePC组1.94±0.19Bb3.04±0.14Bb3.43±0.32Cc1 g/kg JP组1.58±0.24BCb2.58±0.06Cc5.24±0.17Bb2 g/kg JP组2.65±0.41Aa3.85±0.11Aa6.54±0.20Aa4 g/kg JP组1.63±0.06Bb2.03±0.12Dd2.05±0.12Dd10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.012.F001图1JP对黄羽肉鸡血清IL-2 mRNA表达的影响注：1为Marker，2为BC组，3为PC组，4为JP1组，5为JP2组，6为JP4组；IL-2组：7为BC组，8为PC组，9为JP1组，10为JP2组，11为JP4组；下图同。PC组、1 g/kg JP组、2 g/kg JP组和4 g/kg JP组肉鸡血清IFN-γ mRNA表达均极显著高于BC组（P0.01）； 2 g/kg JP组极显著高于PC组、1 g/kg JP组和4 g/kg JP组（P0.01）。JP对黄羽肉鸡血清IFN-γ mRNA表达的影响见图2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.012.F002图2JP对黄羽肉鸡血清IFN-γ mRNA表达的影响PC组、1 g/kg JP组、2 g/kg JP组和4 g/kg JP组肉鸡血清IL-4 mRNA表达均极显著高于BC组（P0.01）；1 g/kg JP组和2 g/kg JP组血清IL-4 mRNA表达均极显著高于PC组（P0.01）；2 g/kg JP组血清IL-4 mRNA表达极显著高于1 g/kg JP组和4 g/kg JP组（P0.01）。JP对黄羽肉鸡血清IL-4 mRNA表达的影响见图3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.012.F003图3JP对黄羽肉鸡血清IL-4 mRNA表达的影响结果表明，JP能够促进IL-2、IFN-γ和IL-4 mRNA的表达，且2 g/kg JP组效果最佳。2.5JP对黄羽肉鸡产蛋性能的影响（见表5）由表5可知，2 g/kg JP组产蛋率极显著高于其他各组（P0.01），PC组和1 g/kg JP组产蛋率均显著高于BC组（P0.05）。PC组、1 g/kg JP组、2 g/kg JP组和4 g/kg JP组平均蛋重均极显著高于BC组（P0.01）；2 g/kg JP组平均蛋重极显著高于PC组、1 g/kg JP组和4 g/kg JP组（P0.01）。2 g/kg JP组平均日采食量极显著高于BC组、PC组和4 g/kg JP组（P0.01），1 g/kg JP组平均日采食量显著高于BC组和PC组（P0.05）。PC组、1 g/kg JP组、2 g/kg JP组和4 g/kg JP组料蛋比均极显著低于BC组（P0.01）；2 g/kg JP组极显著低于1 g/kg JP组（P0.01），显著低于PC组和4 g/kg JP组（P0.04）。结果表明，JP能够提高肉鸡产蛋率、平均蛋重和平均日采食量，降低料蛋比，且2 g/kg JP组效果最佳。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.012.T005表5JP对黄羽肉鸡产蛋性能的影响组别产蛋率/%平均蛋重/g平均日采食量/(g/d)料蛋比BC组73.33±0.31De55.82±0.32De137.23±2.11Bb3.35±0.05AaPC组87.17±0.40Bb58.92±0.32Bb137.55±0.74Bb2.68±0.03Cc1 g/kg JP组80.95±0.93Cd57.44±0.36Cd141.32±1.51ABa3.07±0.02Bb2 g/kg JP组90.65±1.13Aa60.23±0.15Aa143.05±1.58Aa2.61±0.03Cd4 g/kg JP组85.65±0.22Bc57.99±0.33Cc135.27±2.64Bb2.72±0.07Cc3讨论3.1JP对黄羽肉鸡免疫功能的影响淋巴细胞是重要的免疫活性细胞，淋巴细胞分为T细胞和B细胞，T细胞只有受到抗原刺激才能激活，激活的T细胞主要与抗原作用，参与机体的细胞免疫；B细胞受到抗原刺激会分化成浆细胞，产生抗体（免疫球蛋白），与抗原发生中和凝集或裂解，参与机体的体液免疫功能。IL-2由T细胞或T细胞系产生，能够参与造血功能，调控白细胞活性，称为T细胞生长因子。IFN-γ主要由活化的Th1细胞和NK细胞产生，主要功能为免疫调节，活化巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞和NK细胞。IL-4由Th2细胞分泌，在调节适应性免疫和体液免疫中起关键性作用。李凤娇等[11]在体外研究中利用不同浓度JP作用小鼠脾淋巴细胞，发现JP能够促进脾淋巴细胞增殖，促进Th1型细胞因子IL-2、IL-12和Th2型细胞因子IL-6、IL-10分泌及其mRNA的表达。Zou等[12]研究发现，大枣酸性多糖能够促进小鼠血清溶血素的形成，提高脾、胸腺指数，增强巨噬细胞的吞噬功能。苗明三等[13]利用大鼠建立气血双虚模型，在试验期的第1、3、5、7和9 d按每180 g体重尾部放血1 mL，在第2 d腹腔注射环磷酰胺生理盐水液40 mg/kg，在第4、6、8、10和12 d腹腔注射环磷酰胺20 mg/kg；给气血双虚模型的大鼠分别按体重灌服200、100、50、20和10 mg/kg JP，灌服14 d，致死取胸腺和脾制作切片。结果表明，JP能够抑制胸腺和脾的萎缩。Huang等[14]给体重180~220 g大鼠建立慢性肾病模型，切除大鼠部分肾脏，诱导其慢性肾病。慢性肾病模型大鼠每天按体重灌服1.2 g/kg JP，连续灌服90 d。结果表明，JP可以显著降低血清中肌酐、血尿素氮和尿蛋白的含量。Ji等[15]利用6周龄雄性、体重20 g小鼠，建立以AOM/DSS（化学诱变剂/人工合成的硫酸盐多糖）诱发的结肠癌症模型，结肠癌症模型小鼠每天灌服1 000 mg JP，灌服13 w。结果表明，JP能够缩小肿瘤大小，减少肿瘤数量，并通过肿瘤表面坏死限制肿瘤发育。Airing等[16]利用4周龄大鼠建立慢性疲劳综合征模型，大鼠每天喂食2次，并在不确定的时间电击其4次，每次3 min，慢性疲劳综合征模型大鼠每天按体重分别灌服剂量为100、200和400 mg/kg的大枣多糖缀合物（JPC），连续给药30 d。结果表明，JPC可以显著降低血清中MDA含量，提高T淋巴细胞增殖、CD4+/CD8+比值和NK细胞活性。王思凝等[1-2]在1日龄肉鸡基础日粮添加1、2和4 g/kg JP，饲喂42 d，发现JP能够促进IL-2、IFN-γ和IL-4分泌以及mRNA表达，新城疫抗体产生，血淋巴细胞增殖，提高免疫器官指数。王留等[17]、赵耀光等[18]在1日龄肉鸡和蛋鸡基础日粮添加0.5、1.0和1.5 g/kg JP，饲喂45 d，不同浓度JP均能够提高胸腺、法氏囊和脾指数免疫器官指数，促进IgA、IgG和IgM的产生。王中华等[19]在1日龄蛋鸡基础日粮添加0.5、1.0和1.5 g/kg大枣低聚糖，饲喂35 d，发现JP能够提高胸腺、法氏囊和脾指数免疫器官指数，促进IgG和IgA的产生。本研究中，JP能够促进血液中淋巴细胞增殖，提高IgA、IgG和IgM的产生，IL-2、IFN-γ和IL-4分泌以及mRNA表达，表明JP可以激活血液中B细胞，促进B细胞增殖和抗体的产生，提高体液免疫功能；激活T细胞，促进T细胞增殖和分泌细胞因子分泌，提高细胞免疫功能。3.2JP对黄羽肉鸡产蛋性能的影响黄羽肉鸡的产蛋性能够直接影响种鸡的经济效益。本研究中，在黄羽肉鸡基础日粮中添加1、2和4 g/kg JP，能够提高产蛋率、平均蛋重和平均日采食量，降低料蛋比。王思凝等[2]、王留等[17]、赵耀光等[18]、王中华等[19]研究均表明，JP均能提高肉仔鸡免疫功能和生长性能。赵艳秀[20]在420日龄的海兰灰蛋鸡日粮中使用大枣粉代替玉米面，结果发现，大枣粉可以提高蛋鸡采食量，改善肠道环境，提高养分利用率。本研究中，JP能够提高平均日采食量，可能与提高适口性有关。JP能够提高黄羽肉鸡的免疫功能，可能改善了肠道环境，提高营养物质的吸收，提高产蛋率、平均蛋重，从而降低料蛋比。4结论JP能够促进血液中淋巴细胞增殖，免疫球蛋白的产生，细胞因子分泌以及mRNA的表达，从而提高黄羽肉鸡的免疫功能；JP能够提高产蛋率、平均蛋重和平均日采食量，降低料蛋比，从而提高产蛋性能，且2 g/kg JP组效果最佳。