淀粉由葡萄糖分子聚合而成，是自然界中品种较多、产量较大的一类天然高分子化合物[1]。淀粉是谷物类饲料碳水化合物的主要成分，畜禽所需能量的40%由淀粉提供，占畜禽生产成本的50%以上[2]。赵芳芳等[3]指出，日粮淀粉的添加水平、组成类型及结构差异等均会影响动物胃肠道菌群结构。Yu等[4]研究发现，不同来源的膳食淀粉会影响育肥猪的胴体性状及肉品质。因此，测定饲料中的淀粉含量非常重要。目前，测定淀粉含量的方法有微波辅助超声法[5]、碘显色法[6]、近红外光谱法[7]、旋光法[8]、酸水解法及酶水解法[9]等。其中，旋光法、酸水解法及酶水解法有相应的国家标准。王喜萍等[10]研究发现，这3种方法常用于测定淀粉含量，但均具有一定的局限性，需要1种能够准确快速测定饲料中淀粉含量的方法。本研究基于GB 5009.9—2016对酶解法进行改进，省略酶解法中去除脂肪、去可溶性糖及盐酸水解等步骤，本试验的每个待测定样品均做一个待测定样品空白，以保证在试验最终结果中减去样品本身的可溶性糖，保证试验结果的准确性；其次，待测定样品预先经过糊化并用糖化酶及高峰氏淀粉酶组合进行酶解，使待测定样品无须进行盐酸水解就能够保证全部淀粉被水解为单糖；最后，使用分光光度法替代烦琐的手工滴定，减少人为误差。因此，本研究建立快速准确地测定饲料中淀粉的方法，进而监控膨胀玉米、麸皮、次粉等原料的品质，可以为原料的采购和验收提供参考，对饲料质量的安全具有重要意义。1材料与方法1.1试验试剂酚酞指示剂（1 %）、高峰氏淀粉酶溶液（5 g/L）、乙酸-乙酸钠缓冲液（pH值为4.50±0.05）、10 %硫酸溶液、120 g/L钨酸钠溶液、3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂、氢氧化钠溶液（400 g/L）、葡萄糖标准溶液（1 g/L）。糖化酶溶液：取100 000 U/mL糖化酶100 μL，使用乙酸-乙酸钠缓冲液定容至1 mL，此溶液酶活为10 000 U/mL。以上试剂参照GB 5009.9—2016《食品中淀粉的测定》及郭有辉等[11]测定风味鱿鱼中淀粉及蔗糖含量进行配制。1.2试验仪器万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）、分析天平（瑞士（上海）梅特勒托利多仪器有限公司）、涡旋混合仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）、恒温水浴锅（金坛科析仪器有限公司）、紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。1.3试验参数选择通过单因素试验、化学反应原理及紫外可见分光光度计原理等选择称样量、最佳吸收波长、高峰氏淀粉酶及糖化酶加入量等，拟定最佳参数。1.4试验方法1.4.1配置样液准确称取约0.2~1.0 g（精确至0.000 1 g）的两份等量试样置于50 mL具塞比色管，其中一份为待测定样品，另一份为待测定样品空白，平铺于比色管底部，利用移液管加入20 mL乙酸-乙酸钠缓冲液，加入时应注意使用缓冲液把样品冲开，以免粘底，使用涡旋混合仪混匀。将待测定样品置于沸水浴中加热煮沸30 min，每隔10 min使用涡旋混合仪混合1次，使淀粉糊化。流水冷却至50 ℃以下，加入1 mL高峰氏淀粉酶溶液和200 μL糖化酶溶液，50 ℃水浴锅中水浴1 h，每隔10 min使用涡旋仪混合1次，水浴结束冷却至室温。将待测定样品空白置于45 ℃水浴锅，水浴30 min，冷却至室温（测定待测定样品空白的目的是测定样品中原本可溶性还原糖含量，故待测定样品空白不需糊化及酶解，但考虑到部分样品在温度高于50 ℃时淀粉会开始糊化，故待测定样品空白的处理条件为45 ℃水浴锅中水浴30 min）。分别向待测定样品及待测定样品空白中加入2 mL硫酸溶液，涡旋仪混匀；再分别加入2 mL钨酸钠溶液，涡旋仪混匀。加入3滴1%酚酞指示剂，使用40%氢氧化钠溶液调至溶液呈微粉色，使用水定容至刻度，混合均匀，静置10 min，中速定量滤纸过滤，弃去初滤液，其余滤液待测。1.4.2绘制标准曲线配制1 g/L葡萄糖标准溶液，准确称取0.100 0 g经80 ℃干燥2 h的葡萄糖（C6H12O6）标准物质，溶解定容至100 mL。现用现配。取9支25 mL具塞刻度试管，准确加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL葡萄糖标准溶液，加水使总体积为2 mL，加入1.5 mL 3，5-二硝基水杨酸试剂，置于沸水浴中，待水重新沸腾加热5 min。取出，置于冷水中，流水冷却使之快速降温，待冷却至室温，定容，摇匀，待检。所得葡萄糖标准溶液浓度分别为0、0.008、0.016、0.024、0.032、0.040、0.048、0.056、0.064 g/L。以0 g/L葡萄糖标准溶液作空白，使用1 cm比色皿在540 nm波长下进行比色测定。以吸光度值A为纵坐标（y），标液葡萄糖浓度（g/L）为横坐标（x），绘制标准曲线（在测定前先把分光光度计打开预热约30 min）[12]。1.4.3样液的测定准确移取0.2~0.4 mL待测定样品及待测定样品空白（待测定样品及待测定样品空白需移取一样的体积，移取量可以根据样品淀粉含量调整），加水使总体积为2 mL，加入1.5 mL 3,5-二硝基水杨酸试剂，置于沸水浴中，待水重新沸腾时加热5 min。取出，置于冷水中，流水冷却使之快速降温，待冷却至室温，定容，摇匀，使用分光光度计测定540 nm处吸光度。测得待测定样品及待测定样品空白的吸光度，使用待测定样品吸光度减去待测定样品空白吸光度即为待测样品实际吸光度，利用标准曲线计算待测样品的葡萄糖含量（以0 g/L葡萄糖标准溶液校零）。1.4.4可行性试验取次粉，分为4组，分别采用旋光法、酸水解法、酶水解法及本测定方法进行淀粉含量的测定，以现有的旋光法为对照组1，以现有的酸水解法为对照组2，以现有的酶水解法为对照组3，以本测定方法为试验组，分别对比4种方法对同一次粉样品淀粉的测定结果。1.4.5精确度试验应用样品的加标回收试验验证本研究的精确度，采用低、中、高浓度水平（0.1、0.5、1.0 mg/kg），每个浓度梯度平行测定5次。1.4.6重复性试验测定同一个次粉及豌豆中5份样品的淀粉含量。2结果与分析2.1绘制标准曲线标液葡萄糖含量检测结果见表1。葡萄糖浓度标准曲线见图1。由表1、图1可知，分光光度法检测葡萄糖浓度为0.008~0.064 g/L时，其吸光度与葡萄糖含量线性关系良好，R2=0.999 5，回归方程为y=19.594x-0.079。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.024.T001表1标液葡萄糖含量检测结果管号葡萄糖含量/mg葡萄糖浓度/(g/L)吸光度10.20.0080.07620.40.0160.22830.60.0240.38740.80.0320.55951.00.0400.71161.20.0480.87371.40.0561.00581.60.0641.17210.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.024.F001图1葡萄糖浓度标准曲线2.2样品检测结果2.2.1可行性试验不同方法检测淀粉含量的测定结果见表2。由表2可知，本测定方法（36.19%）、旋光法（36.00%）及酶水解法（36.23%）与现有的酸水解法（52.78%）测定结果差异较大，一定程度上说明酸水解法并不适用于次粉淀粉含量的测定；本测定方法与旋光法测定差值为0.19%，与酶水解法测定的结果差值为0.04%，符合旋光法及酶水解法中的再现性要求，表明本测定方法有效可行，可以用本测定方法测定饲料中的淀粉含量。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.024.T002表2不同方法检测淀粉含量的测定结果组别平行1平行2平行3平行4平行5平均值对照组135.9836.0336.1536.0035.8536.00对照组251.7553.5052.8053.7152.1652.78对照组336.2636.2836.1536.2136.2736.23试验组36.1136.2436.1836.1736.2636.19%2.2.2精确度试验（见表3）由表3可知，淀粉的平均回收率为95.3%~98.7%，5次平行测定结果的标准偏差为1.6~2.8。因此，本测定方法的精确度高，满足化学分析方法确认和验证的技术要求[13]。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.024.T003表3精确度试验水平淀粉加入浓度/(mg/kg)平均回收浓度/(mg/kg)平均回收率/%标准偏差/%低0.100 40.956 895.32.8中0.507 80.488 596.21.6高1.001 10.988 198.72.12.2.3重复性试验结果（见表4）由表4可知，次粉样品5次平行测定结果的标准偏差为0.06%，豌豆样品5次平行测定结果的标准偏差为0.30%。因此，本测定方法的重复性好，满足化学分析方法确认和验证的技术要求，测量结果的准确性进一步得到保证[13]。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.024.T004表4重复性试验结果组别平行1平行2平行3平行4平行5标准偏差次粉36.1136.2436.1836.1736.260.06豌豆42.6842.7942.0342.3542.560.30%2.3不同测定淀粉含量方法间的比较（见表5）由表5可知，淀粉常与单糖类的葡萄糖、果糖等共处，因此，以国家标准中的酸水解法来测定还原糖以此计算淀粉含量，通常会使部分饲料样品测定的结果偏高。此外，蒋雁[14]指出，酸水解的温度及时间均会影响淀粉的测定结果，因此各企业主要使用旋光法及酶水解法测定淀粉含量。旋光法测定淀粉含量时需提前测定各样品的耗酸量，对所用试剂盐酸的浓度要求非常高，存在制样较烦琐、仪器较昂贵、难以推广等问题[15]。酶水解法测定淀粉含量准确度最高，但也存在单次测定的样品量较少及操作烦琐费时等问题[16]。为了克服上述现有技术的弊端，本研究通过对酶水解法进行优化改进，建立1种简便易行、精确度高及重复性好的快速测定饲料中淀粉含量的方法。与旋光法、酸水解法及酶水解法相比，本测定方法具有测定结果精确度高、操作简便易行、测定快速、单次样品检测量多及适用范围广等优势，适宜推广使用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.024.T005表5不同测定淀粉含量方法间的比较测定方法依据标准特点烦琐程度适用范围旋光法GB/T 20194—2018适用范围较窄，样品处理过程要求很严格，处理产品时的温湿度、盐酸溶液浓度、沸水浴时间及是否保持沸腾均会影响测定结果烦琐不适用于含有光学活性且不溶于40%乙醇的淀粉以外的物质，或是富含葡萄糖或含直链淀粉超过40%的样品酸水解法GB 5009.9—2016部分样品测定结果偏高（会使淀粉以外的高分子碳水化合物水解）简便适用淀粉含量高，且纤维含量低的谷物籽实饲料酶解法GB 5009.9—2016淀粉酶只水解淀粉而不水解半纤维素、果胶等多糖，具有较强专一性，测定结果准确度最高，但酶制剂种类和批次差别大烦琐均适用本测定方法综合了酶解法的所有优点，利用高峰氏淀粉酶与糖化酶组合作用，将淀粉全部水解为葡萄糖，减少酶制剂种类及批次差别对试验结果的影响，具有较强的专一性，测定结果准确度高，并且应用3，5-二硝基水杨酸法测定水解产物从而计算淀粉含量，操作更为简便，测定更为快速简便均适用3讨论本研究对酶解法进行改进优化，简化酶解法中较为烦琐的步骤，如去除脂肪、去可溶性糖、盐酸水解及手工滴定等步骤，通过样品预先糊化、高峰氏淀粉酶及糖化酶的组合应用、加测待测样品空白及比色法测定等简化试验步骤、缩短试验时间及增大单次样品的检测量等，同时，通过方法的比较、精确度及重复性分析，建立了1种新的检测饲料中淀粉含量的方法。根据试验验证结果，本研究的精确度及重复性均满足化学分析方法确认和验证的技术要求，且本研究对饲料样品淀粉含量的检测结果与现有的旋光法、酶水解法测定的结果差别不大，表明本测定方法有效可行，可采用本测定方法对饲料中的淀粉进行测定。本试验中，葡萄糖浓度为0.008~0.064 g/L时，其吸光度与葡萄糖含量线性关系良好，R2=0.999 5，回归方程为y=19.594x-0.079；在精确度试验中，淀粉平均回收率为95.3%~98.7%，5次平行测定结果的标准偏差为1.6~2.8；在重复性试验中，相对标准偏差均小于0.5%，均满足化学分析方法确认和验证的技术要求。同时，本研究测定结果与旋光法、酶解法测定的结果较为接近，但与酸水解法差异较大，说明本测定方法有效可行，可以客观准确的测定淀粉含量，也表明酸水解法测定饲料中淀粉含量的适用范围有限，不适宜测定次粉的淀粉含量。故可以采用本测定方法实现对饲料中的淀粉含量进行测定，监控饲料原料及成品的品质，为原料的采购和验收提供参考。4结论本研究测定饲料中的淀粉含量方法具有简便易行、快速、精确度高及重复性好等优点，可以作为饲料中淀粉含量检测的常规方法。