藏猪是我国宝贵的地方品种资源，具有繁殖力低、成活率低的特点，因此提高仔猪的存活率是藏猪养殖的重要任务。藏猪仔猪黄痢病是藏猪养殖过程中常发疾病，其发病时间早、发病急、流行性广、病死率较高、易产生耐药性[1]，导致该病临床治疗极其困难。试验通过对藏猪仔猪黄痢病原菌分离、纯化、鉴定，对分离的菌株进行药敏试验，筛选出敏感药物，为藏猪养殖户合理用药提供参考。1材料与方法1.1试剂抗菌药物药敏纸片（杭州微生物试剂有限公司）、营养琼脂（NA）（上海博微生物科技有限公司BW006）、麦康凯琼脂培养基（MAC）（上海博微生物科技有限公司20200715）、三糖铁琼脂培养基（TSI）（杭州微生物试剂有限公司M0001）、LB琼脂（上海博微生物科技有限公司）、伊红亚甲蓝琼脂培养基（EMB）（上海博微生物科技有限公司）、肠杆菌科生化鉴定试剂盒（广州环凯微生物有限公司HKI006）等。1.2仪器超净工作台、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅、病料袋、手套、无菌牙签、棉签、无菌培养皿、试管、离心管、记号笔、标签纸、装有冰袋的泡沫箱等。1.3病料来源四川省甘孜州康定市姑咱镇附近藏猪2020~2021年仔猪黄痢病例。1.4试验方法1.4.1粪便采集选取临诊时发现的疑似病例，从每窝中选择典型的发病仔猪的新鲜粪便，使用干净的竹签深入粪便内部多角度取材，取材范围要求大小不低于3 cm直径。1.4.2病原菌分离将采集病料使用生理盐水按照1∶9比例稀释，接种于普通营养琼脂平板上，37 ℃培养24 h，观察细菌生长情况；挑选普通培养基分离的菌落分别接种于麦康凯琼脂、伊红亚甲蓝琼脂平板上，37 ℃培养24 h，观察细菌生长情况。1.4.3生化试验将初次分离的菌株使用肠杆菌科生化鉴定试剂盒进行常规生化试验及三糖铁斜面试验。1.4.4药敏试验使用抗菌药物药敏纸片（杭州微生物试剂有限公司），并采用K-B纸片扩散法进行药敏试验[2]，测其抑菌圈大小，根据说明书判定病原菌对药物的敏感性。将分离出的菌株进行10-1稀释，使用1~100 μL的移液枪移取20 μL菌液涂布于准备好的营养琼脂培养基培养皿上，选取药敏片进行均匀的贴区（5区，见图1），每种药物3组平行试验，培养24 h，观察其生长情况。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.11.009.F001图1药敏试验Fig.1Drug sensitivity test2结果与分析2.1细菌分离、纯化培养结果2.1.1普通营养琼脂培养结果（见图2）由图2可知，平板上形成多数单个圆形菌落以及少许成片的菌苔，颜色为乳白色，形态为半透明，表面湿润、凸起，表面及边缘较光滑。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.11.009.F002图2普通营养琼脂Fig.2Common nutrient agar2.1.2麦康凯琼脂培养结果（见图3）由图3可知，平板上形成红色单个菌落或红色菌苔，表面光滑湿润微凸，边缘整齐。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.11.009.F003图3麦康凯培养基Fig.3MacConkey medium2.1.3伊红亚甲蓝琼脂培养结果（见图4）由图4可知，平板上形成黑色具有金属光泽、边缘整齐、圆形、表面微隆起的单个菌落或少许菌苔。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.11.009.F004图4伊红亚甲蓝培养基Fig.4Eosin blue medium2.1.4染色镜检（见图5）选取麦康凯平板上的单个菌落进行革兰氏染色，镜检。由图5可知，视野中出现粉红色、两端钝圆、短杆及少许长杆、散在或是成对出现的革兰氏阴性细菌。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.11.009.F005图5镜检结果Fig.5Microscopic results2.2分离菌株生化鉴定结果（见表1、表2）由表1、表2可知，并对照配套说明书，综合判定该菌株属于ATCC类中的大肠埃希菌属。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.11.009.T001表1分离菌株生化试验鉴定结果Tab.1Biochemical test and identification results of isolated strains项目呈阳性菌株数/株阳性占比/%呈阴性菌株数/株阴性占比/%柠檬酸盐0010100MUG990110棉籽糖0010100纤维二糖0010100山梨醇10000赖氨酸1010000鸟氨酸990110氨基酸对照0010100靛基质990110VP试验0010100甲基红1010000动力1010000氧化酶试验0010100注 ：每种3组平行试验，氨基酸对照黄色表示阴性。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.11.009.T002表2三糖铁斜面试验结果Tab.2Experimental results of trisugar iron inclined plane组别斜面底层产气硫化氢菌株1A（K）A+-菌株2KA+-菌株3AA+-菌株4AK+-菌株5AA+-菌株6AA+-菌株7A（K）A+-菌株8AA+-菌株9KA+-菌株10AA（K）+-注 ：A为产酸（黄色），K为产碱（红色），+为阳性，-为阴性，（K）为少有现象。2.3分离菌株药敏试验结果（见表3）由表3可知，分离的10株菌株对头孢呋辛、头孢氨苄、头孢哌酮、头孢他啶、头孢拉啶、头孢曲松、头孢唑啉、环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、复方新诺明、呋喃唑酮、卡那霉素、庆大霉素、哌拉西林、羧苄西林、丁胺卡那、氯霉素、米诺环素等19种药物敏感；对多西环素、克林霉素、多黏菌素、新霉素4种药物中度敏感；对青霉素、氨苄西林、苯唑西林、红霉素、麦迪霉素、四环素、万古霉素7种药物则呈现出不同程度的耐药性。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.11.009.T003表3病原菌对30种抗菌药物的敏感性Tab.3Susceptibility of pathogenic bacteria to 30 kinds of antibiotics药物名称抑菌圈平均直径/mm判断标准（直径/mm）敏感性耐药中敏敏感头孢呋辛21.50≤1415～17≥18S头孢拉啶19.67≤1415～17≥18S头孢唑啉22.50≤1415～17≥18S头孢氨苄18.67≤1415～17≥18S头孢哌酮33.25≤1516～20≥21S头孢曲松31.25≤1415～17≥18S头孢他啶27.33≤1415～17≥18S青霉素3.33≤1920～27≥28R氨苄西林16.67≤1819～25≥26R苯唑西林0≤1011～12≥18R卡那霉素21.33≤1314～17≥18S庆大霉素22.17≤1213～14≥15S哌拉西林23.83≤17—≥18S羧苄西林26.83≤1314～16≥17S新霉素16.67≤1213～16≥17I丁胺卡那22.67≤1415～16≥17S四环素14.50≤1819～22≥23R多西环素15.33≤1213～16≥17I米诺环素20.42≤1314～17≥18S氯霉素21.57≤1718～20≥21S红霉素13.83≤1516～20≥21R麦迪霉素0≤1314～17≥18R克林霉素3.33≤1516～18≥19R多黏菌素8.35≤88～11≥12I环丙沙星29.42≤1516～20≥21S诺氟沙星30.58≤1213～16≥17S氧氟沙星29.08≤1213～15≥16S呋喃唑酮28.17≤1415～16≥17S复方新诺明24.17——≥18S万古霉素10.67——≥17I/R注 ：耐药（R），中敏（I），敏感（S）。3讨论通过对细菌分离纯化鉴定表明，分离的10株藏猪仔猪黄痢病原菌均为大肠埃希菌，属革兰氏阴性菌。分离菌株主要对头孢菌素类、喹诺酮类、氨基糖苷类、磺胺类等药物敏感，主要原因是氨基糖苷类药物主要通过转运系统利用细胞膜将细胞外孔蛋白的药物摄入细胞内，使胞内药物大量蓄积，影响肽链的延长和蛋白质合成，造成蛋白质翻译错误，从而导致细胞膜出现裂痕、胞内的AMP、K+等重要物质外泄，使细菌死亡[3]。头孢菌素类对革兰阴性菌的外膜透过性较好，属广谱抗菌类药物[4]。磺胺类药物通过抑制菌体在叶酸代谢循环过程中合成二氢叶酸，进而抑制细菌DNA及蛋白质的合成，使细菌生长繁殖迟缓[5]。喹诺酮类药物主要通过抑制细菌DNA螺旋酶的A亚单位以及拓扑异构酶Ⅱ，干扰DNA正常的复制转录等，使细菌死亡而发挥作用[6]。试验中的菌株对青霉素类、部分大环内酯类、四环素类、糖肽类等药物呈现低敏或耐药，一方面是由于药物作用的机制不同，如，青霉素类药物主要通过抑制胞壁粘肽合成酶（青霉素结合蛋白，PBPs）而阻碍细胞壁粘肽合成，引起细菌胞壁缺损，使菌体膨胀裂解而亡[7]；由于革兰氏阴性菌细胞壁肽聚糖含量少，且具有由脂多糖、脂质双层（磷脂）、脂蛋白组成的糖蛋白磷脂外膜[8]，阻碍药物进入到胞内，故与革兰氏阳性菌相比不容易受到青霉素类药物的影响；同理，糖肽类药物目前主要是治疗革兰氏阳性菌，而大肠埃希氏菌是革兰氏阴性菌，因此试验中分离菌株对万古霉素不敏感[9]。另一方面则是由于不合理用药导致病原菌对药物产生了耐药性。该地区藏猪养殖场猪发病时，主要根据以往经验用药。同一类型药物使用频率过高，或疗程不足时频繁更换以及盲目联合使用抗菌类药物均促使耐药菌株代替敏感菌株，产生耐药性。但致病菌对不同药物其产生耐药的作用机制也有所差异，主要与结构、功能等变化有关。如PBPs是β-内酰胺类抗生素的特异性靶蛋白，目前已证实PBPs的结构和数量的改变是引起细菌产生耐药性的重要原因之一[10]。细菌对四环素耐药主要是由于其所带的耐药质粒可诱导产生新蛋白，阻塞细胞壁水孔，细菌浆膜通透性发生改变，药物无法进入[11]。此外，细胞膜表面膜蛋白的结构、数量、形态等改变也会导致细菌产生耐药性。细菌生物被膜（BF）是一种黏附定植式包膜，具有特定的基因表达模式，当抗菌药物作用于BF时触发特定基因表达，使具有BF的细菌对该药物产生耐药性。有研究表示，目前已被证实具有生物被膜的动物源性细菌有大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、假结核棒状杆菌等，由此本试验中分离的大肠埃希菌对部分药物产生耐药性也可能与BF有关[12]。4结论试验从藏猪仔猪黄痢病例粪便中分离得到10株病原菌，经分离鉴定其为大肠埃希菌。结果表明，该菌株对头孢菌素类、喹诺酮类、磺胺类、硝基呋喃类、氨基糖苷类、酰胺醇类等药物敏感，对青霉素类、部分大环内酯类、四环素类、糖肽类等药物低敏或产生了不同程度的耐药性。建议该地区后期治疗该病时选择国家批准的敏感性药物治疗，规范使用抗生素或抗菌药物，尽量避免致病菌产生耐药性。