肉牛在快速育肥期间需要增加日粮的能量浓度。油脂的能量浓度远高于碳水化合物和蛋白质，是重要的饲料能量来源[1]。植物油脂比谷实和糠麸类饲料所含能量高，而且还可以提高不饱和脂肪酸在体内的转运。因此，在日粮中添加植物油脂是解决肉牛育肥过程中所需能量简便、快速且有效的方法[2]。研究表明，在反刍动物日粮中添加适量植物油可以调控瘤胃发酵，降低瘤胃甲烷排放，改善动物的生产性能[3-4]。饲料中添加油脂不但能够满足肉牛育肥过程中对能量的需要，还可以减少甲烷的排放和能量损失，提高饲料利用率[5-6]。但是，油脂对瘤胃微生物有较强的抑制作用，并对饲料颗粒具有包被作用，影响瘤胃微生物对饲料的利用[7]。当日粮中油脂含量达到一定浓度时，可能影响瘤胃的正常发酵。大豆油是大豆经过一系列加工提炼而成的植物油脂，产量高、来源广泛、营养价值高。研究表明，日粮中添加大豆油能够调控瘤胃液pH值、脂肪酸浓度及瘤胃微生物相对丰度，能够提高山羊日增重和养分消化率，降低料重比和能量代谢率，显著降低单位增重和甲烷排放量[8-11]。目前，有关大豆油在肉牛瘤胃发酵上的研究较少。因此，本研究利用体外瘤胃发酵技术，探究不同添加水平的大豆油对肉牛瘤胃体外发酵产气量、甲烷产量及发酵参数的影响，初步确定大豆油在日粮中的适宜添加水平，为大豆油在肉牛的育肥生产实践中提供参考。1材料与方法1.1试验材料瘤胃液供体动物选取3只体重（250±15）kg、体况良好、安装有永久性瘤胃瘘管的锦江黄牛，每日按肉牛维持需要水平饲喂，8：00和17：00等量饲喂，自由饮水。大豆油选用市售金龙鱼品牌的大豆油。发酵底物由过1 mm筛的精料和黑麦草草粉组成（1∶1）。发酵底物精料组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.19.008.T001表1发酵底物精料组成及营养水平项目大豆油添加水平03%6%9%12%原料组成/%大豆油03.006.009.0012.00玉米69.6066.6063.6060.6057.60麦麸13.0013.0013.0013.0013.00豆粕12.0012.0012.0012.0012.00磷酸氢钙1.801.801.801.801.80食盐1.001.001.001.001.00石粉1.601.601.601.601.60预混料1.001.001.001.001.00合计100.00100.00100.00100.00100.00营养水平综合净能/(MJ/kg)7.267.597.928.258.58干物质/%88.5388.5488.5588.5688.57粗蛋白/%13.0212.7612.5012.2411.98粗脂肪/%3.826.709.5912.4715.35粗纤维/%3.163.113.053.002.96钙/%1.151.151.141.141.13磷/%0.610.610.600.590.59注：1.每千克预混料中含有：VA 300 kIU、VD 100 kIU、VE 1 200 mg、铁4 000 mg、铜600 mg、锌2 500 mg、锰3 000 mg、碘60 mg、钴30 mg、硒20 mg。2.营养水平均为计算值。1.2人工瘤胃液的配制晨饲前抽取3头肉牛的瘤胃液混合均匀，装入保温杯密封，厌氧手套箱中过4层纱布备用。人工唾液配置参考Menke等[12]的方法。1∶2的比例充分混合瘤胃液和人工唾液，制备人工瘤胃液。整个操作过程在39 ℃的恒温水浴锅中进行，通入CO2保持厌氧环境，使人工瘤胃液由蓝色转变为粉红色，最终为无色。1.3试验设计试验采用完全随机试验设计，将500 mg的发酵底物置于150 mL产气瓶中。试验分为对照组和处理组，处理组大豆油的添加量分别为底物干物质的3%、6%、9%和12%。产气瓶中加入预热的人工瘤胃液60 mL，瓶中通入CO2（5 s），盖上瓶塞，将产气瓶置于恒温摇床，100 r/min、39 ℃培养12、24、48 h。每组设置5个重复，试验重复3次，并设置空白对照组。1.4发酵样品采集与处理培养12、24、48 h，将产气瓶取出放入冰水浴中终止发酵，将产气瓶中的发酵液取出，放入50 mL塑料离心管中，测定发酵液的pH值。发酵液在5 000×g离心10 min，取上清液用于氨态氮（NH3-N）、微生物蛋白（MCP）和挥发性脂肪酸（VFA）的测定，固相残渣用于干物质降解率的测定。1.5测定指标及方法1.5.1气体产量的测定参照Romero-Pérez等[13]的方法，使用压力传感器测定产气瓶内的压力值，结合产气瓶容积换算出产气瓶中的实际产气量。VGP=P×(V1-V2)/101.3×W(1)式中：VGP为产气瓶的实际产气量（mL）；P为实际测出的压力值（kPa）；V1为产气瓶的容积（mL）；V2为加入人工瘤胃液的容积（mL）；W为底物干物质质量（g）。1.5.2甲烷产量的测定采用Menke等[12]的气相色谱法条件测定甲烷含量。色谱条件：载气为高纯氮气，燃气为高纯氢气，空气为助燃气，柱温70 ℃，前进样口温度50 ℃、后进样口温度375 ℃、FID检测器温度200 ℃、空气流速360 mL/min、氢气流速45 mL/min、氮气流速25 mL/min。1.5.3pH值的测定采用酸度计对发酵液的pH值进行测定，测定之前对酸度计进行校正。1.5.4NH3-N浓度的测定参考冯宗慈等[14]改进的比色法对发酵液中NH3-N浓度进行测定。采用标准系列溶液制作标准曲线，得到回归方程，用酶标仪检测待测样本700 nm的吸光值，根据回归方程计算样品中的NH3-N浓度。1.5.5MCP浓度的测定参考杨德莲等[15]的方法对发酵液中MCP浓度进行测定。取经预处理去除原虫和饲料大颗粒的上清液1 mL，16 000×g离心20 min，弃去上清液，沉淀的细菌部分加0.9 mL的10%三氯乙酸溶液，混匀，4 000 r/min离心10 min，取沉淀物加5%氢氧化钠溶解，稀释至2.5 mL。4 000 r/min离心10 min，紫外分光光度计测定上清液280 nm和260 nm吸光值。计算细菌蛋白质含量。蛋白质含量(g/L)=(1.45×OD280 nm-0.74×OD260 nm)(2)1.5.6VFA含量的测定参考王加启[16]的方法，使用气相色谱测定发酵液中挥发性脂肪酸含量。取发酵液1 mL于1.5 mL离心管中，4 ℃、13 000×g离心10 min。上清液转移至加有20 μL 85%正磷酸的1.5 mL离心管中，充分混匀，4 ℃、13 000×g离心10 min。上清液过0.22 μm水系滤膜，打入气相上样瓶自动进样至气相色谱仪的火焰离子化检测器进样口进行测定。1.6数据统计与分析采用Excel 2010进行数据的初步统计处理，采用SPSS 16.0软件对数据进行单因素方差分析，采用Duncan's法进行多重比较，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1不同大豆油水平对瘤胃体外发酵产气量和甲烷产量的影响（见表2）由表2可知，发酵3 h时，12%大豆油组的产气量显著低于对照组和3%大豆油组（P0.05）；发酵6、9、12、24、48 h时，6%、9%和12%大豆油组产气量和甲烷产量均显著低于对照组和3%大豆油组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.19.008.T002表2不同大豆油水平对瘤胃发酵产气量和甲烷产量的影响项目大豆油添加水平SEMP值03%6%9%12%产气量3 h36.98a37.23a34.43ab33.06ab31.90b2.020.0696 h67.53a68.13a62.85b61.77b58.38b2.110.0029 h111.14a110.34a104.58b101.14bc96.97c2.580.00112 h140.99a141.27a133.15b129.84b123.51c2.900.00124 h193.63a193.55a183.63b179.76b173.16c2.700.00148 h234.28a233.97a220.91b216.19b209.25c2.840.001甲烷产量3 h2.302.272.232.202.230.060.5696 h3.51a3.40ab3.20b3.12bc2.89c0.150.0059 h5.43a5.17a4.70b4.55bc4.31c0.170.00112 h5.78a5.49a4.98b4.92b4.66b0.170.00124 h10.15a9.87a9.27b9.08bc8.80c0.160.00148 h12.93a12.65a11.38b10.74c10.17d0.160.001注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著（P0.05），字母相同或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。mL2.2不同大豆油水平对pH值、NH3-N、MCP浓度和干物质降解率的影响（见表3）由表3可知，随着培养时间延长，各组pH值呈现降低趋势。发酵12 h，6%、9%和12%大豆油组pH值显著高于对照组和3%大豆油（P0.05），6%大豆油组pH值显著低于9%和12%大豆油组（P0.05）。发酵24 h，9%和12%大豆油组pH值显著低于6%大豆油组（P0.05）。发酵48 h，9%大豆油组pH值显著高于3%大豆油组（P0.05）。发酵24 h和48 h，9%和12%大豆油组发酵液中NH3-N浓度显著低于对照组、3%和6%大豆油组（P0.05）；9%和12%大豆油组发酵液中MCP浓度显著低于对照组、3%大豆油组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.19.008.T003表3不同大豆油水平对pH值、NH3-N、MCP浓度和干物质降解率的影响项目大豆油添加水平SEMP值03%6%9%12%pH值12 h6.96c6.95c7.03b7.07a7.09a0.020.00124 h6.86ab6.85b6.89a6.83b6.83b0.020.00448 h6.72ab6.70b6.73ab6.77a6.74ab0.030.060干物质降解率/%12 h48.0847.8448.2047.9647.360.880.89424 h60.6160.5759.6959.9759.210.740.30248 h71.5070.6069.3369.7069.072.190.795NH3-N/(mg/L)12 h126.37127.44126.48125.00124.151.780.42324 h177.36a175.00a170.94a162.96b159.45b4.210.00748 h222.52a220.93a217.13a208.97b204.42b4.650.012MCP/(mg/100 mL)12 h32.6933.1734.1733.5133.111.170.77624 h40.92a41.67a39.01ab36.89b34.83b1.610.00248 h54.76a55.82a53.47ab50.13b49.60b1.770.0062.3不同大豆油水平对VFA的影响（见表4）由表4可知，发酵12 h，6%、9%和12%大豆油组总挥发性脂肪酸（TVFA）、乙酸浓度显著低于对照组和3%大豆油组（P0.05）；6%、9%和12%大豆油组丙酸浓度显著低于3%大豆油组（P0.05）；3%大豆油组丁酸浓度显著高于9%和12%大豆油组（P0.05）；3%大豆油组乙酸/丙酸比值显著低于9%和12%大豆油组（P0.05）。发酵24 h，9%和12%大豆油组丁酸浓度显著低于对照组和3%大豆油组（P0.05）；6%、9%和12%大豆油组乙酸/丙酸比值显著低于对照组和3%大豆油组（P0.05）；6%和9%大豆油组乙酸/丙酸比值显著高于12%大豆油组（P0.05）。发酵48 h时，3%大豆油组乙酸和丙酸浓度显著高于9%大豆油组（P0.05），6%大豆油组乙酸/丙酸比值显著低于对照组、3%和12%大豆油组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.19.008.T004表4不同大豆油水平对VFA的影响项目大豆油添加水平SEMP值03%6%9%12%总挥发性脂肪酸(g/L)12 h4.90a5.46a4.09b4.04b3.98b0.350.00624 h4.604.634.534.704.870.220.59448 h5.465.755.445.165.360.260.335乙酸(g/L)12 h3.02a3.31a2.51b2.48b2.47b0.180.00224 h2.952.962.802.902.960.130.68948 h3.40ab3.58a3.30ab3.14b3.27ab0.160.163丙酸(g/L)12 h1.30ab1.49a1.06b1.03b1.01b0.110.00724 h1.131.141.141.181.250.060.26948 h1.39ab1.47a1.40ab1.31b1.35ab0.070.261丁酸(g/L)12 h0.58ab0.65a0.53ab0.52b0.51b0.060.13824 h0.53b0.52b0.59ab0.63a0.66a0.030.00348 h0.670.700.740.710.730.040.454乙酸/丙酸12 h2.33ab2.23b2.37ab2.41a2.45a0.070.07824 h2.61a2.59a2.46b2.45b2.37c0.030.00148 h2.44a2.43a2.37b2.39ab2.42a0.020.0333讨论3.1不同大豆油水平对产气量和甲烷产量的影响体外发酵产气量可作为反映饲料可降解程度的重要指标，能够在一定程度上反映瘤胃内微生物活动的总体情况和饲料可消化性[17]。廖健硕[18]研究发现，在日粮中添加4%大豆油显著降低山羊瘤胃体外发酵中的产气量。乌日娜等[19]研究发现，在日粮中添加大豆油显著降低徐淮白山羊瘤胃体外发酵中的产气量，且随大豆油添加水平的升高而降低。本试验中，添加6%、9%和12%大豆油均能够显著降低产气量，产气量随着大豆油添加浓度升高而降低，表明高浓度的大豆油抑制了瘤胃的发酵，产气量的变化趋势可能与大豆油影响了瘤胃微生物的活性有关；另外，高浓度大豆油组发酵底物中玉米含量低于低浓度大豆油组，使底物中可发酵有机物淀粉等物质含量减少，最终导致产气量降低。反刍动物瘤胃内，氢气还原二氧化碳形成甲烷，其次甲酸、乙酸和丁酸等挥发性脂肪酸也可以合成甲烷[20-22]。乌日娜等[19]研究发现，在日粮中添加大豆油能够降低徐淮白山羊瘤胃体外发酵中的甲烷产量，且随大豆油添加水平的升高而降低。本试验中，添加6%、9%和12%大豆油均能够显著降低甲烷产量，甲烷产量随着大豆油添加浓度升高而降低，可能是因为高浓度大豆油对产甲烷菌活性产生了抑制作用，导致甲烷产量降低，而产甲烷菌对低浓度的大豆油有一定的耐受性，所以低浓度的大豆油对甲烷产量影响不显著；另外，合成甲烷的原料甲酸、乙酸和丁酸等挥发性脂肪酸浓度的降低也是甲烷产量降低的原因之一。3.2不同大豆油水平对NH3-N和MCP浓度的影响NH3-N浓度是反刍动物瘤胃消化代谢过程中的重要产物，也是微生物合成菌体蛋白的原料，瘤胃中NH3-N含量直接反映瘤胃内环境的发酵情况[23-25]。研究发现，日粮中添加大豆油可以降低瘤胃液中NH3-N和MCP浓度[10,18,26]。本研究中，添加高浓度大豆油能够显著降低发酵液中NH3-N浓度，可能因为高浓度的大豆油对瘤胃微生物起到抑制作用，降低微生物利用碳水化合物的能力，导致NH3-N合成减少。本研究中，添加高浓度大豆油显著降低发酵液中MCP含量，可能是由于合成MCP的NH3-N减少，导致发酵液中MCP含量降低；高浓度大豆油对瘤胃微生物具有抑制作用，可以降低微生物的繁殖速度，也导致发酵液中MCP含量降低，表明NH3-N含量与MCP的含量密切相关，与Srinivas等[27]研究结果一致。3.3不同大豆油水平对VFA和pH值的影响VFA是反刍动物瘤胃中微生物发酵碳水化合物的主要产物，VFA主要包括乙酸、丙酸和丁酸，占TVFA的95%，VFA也是反刍动物能量的重要来源，VFA的浓度和组成直接反映瘤胃的消化代谢情况[28-29]。Yousefinejad等[30]研究发现，雌性荷斯坦奶牛日粮中添加大豆油会导致瘤胃VFA浓度有降低趋势，丁酸和乙酸比例降低。Shang等[26]研究发现，在荷斯坦公牛日粮中添加大豆油，降低了乙酸比例，升高了丙酸比例。本试验中，大豆油添加水平增至6%时，发酵12 h后，TVFA、乙酸和丙酸显著降低，乙酸/丙酸比值在发酵24 h和48 h后显著降低；大豆油添加水平为3%时，TVFA、乙酸、丙酸和丁酸均有升高的趋势，乙酸/丙酸比值有下降的趋势，但无差异显著性。表明在添加少量大豆油时对瘤胃发酵无显著影响，并不会抑制微生物对底物的发酵。研究发现，日粮中植物油的添加水平低于3%时，VFA的浓度增加，当添加水平增至4%时，其浓度有降低的趋势[25]，与本研究结果基本一致。瘤胃pH值是反映反刍动物瘤胃内环境的重要指标，而VFA含量和组成及唾液的分泌等多种因素的变化均会导致瘤胃液pH值变化。本研究中，添加大豆油发酵12 h时，pH值显著升高，但各处理组的pH值均在瘤胃正常的pH值（6.37~7.35）内，不影响瘤胃微生物生长发育及发酵[31]。本研究中，添加大豆油对干物质降解率无显著影响，表明大豆油对发酵底物降解无影响，与孙玲玲等[25]研究结果一致。4结论添加6%、9%和12%大豆油显著降低甲烷产量、总产气量、TVFA、NH3-N和MCP浓度，抑制瘤胃发酵，对反刍动物不利。添加3%大豆油对总产气量、TVFA、NH3-N、MCP浓度无显著影响。因此，体外发酵条件下大豆油的适宜添加水平为3%。