淀粉酶是工业生产中使用的重要酶制剂之一，能够水解淀粉生成小分子聚合物或葡萄糖单元[1-2]。淀粉酶被广泛应用在食品业、发酵业、制药业和饲料行业[3]。在畜禽生产中，饲料中的淀粉会增加动物消化道中食糜黏度，黏度过高会影响营养物质的吸收并危害肠道健康。动物体自身分泌的淀粉酶对饲料中淀粉的降解有限，添加淀粉酶能够提高畜禽对淀粉的利用效率和饲料的营养价值，起到节约饲粮、维护肠道健康的作用。自然界中的淀粉酶源自动物、植物和微生物。其中，微生物源的淀粉酶更有利于大规模生产，在工业应用中具有重要价值[4]，能够生产淀粉酶的微生物主要是芽孢杆菌、曲霉及酵母[5-6]。使用微生物生产淀粉酶具有成本低、效率高、易于提取、可大规模生产等优点，产淀粉酶菌株也可用于发酵生产生物饲料[7-8]。因此，本研究拟从自然环境中筛选产淀粉酶菌株，对其进行形态学和分子生物学鉴定，分析其酶学特性及产酶规律，为饲料添加剂及生物饲料的生产提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1样品的采集样品采自河南省洛阳市河南科技大学校内培育田10 cm深处土壤。1.1.2试剂和培养基培养基配置和酶活测定所需试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。DNS试剂：参照文献[9]配置，常温条件下静置7 d，有效期为6个月。初筛固体培养基：可溶性淀粉20 g、牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、琼脂20 g、蒸馏水1 000 mL。种子培养基：牛肉膏5 g、蛋白胨 10 g、NaCl 5 g、蒸馏水1 000 mL。发酵培养基：可溶性淀粉20 g、蛋白胨10 g、酵母粉5 g、磷酸氢二钾1 g、NaCl 1 g、蒸馏水1 000 mL。上述培养基配置结束，均121 ℃、0.1 MPa灭菌20 min。1.1.3仪器设备立式高压蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）、JA-2003型电子精密天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）、分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）、ReadMax-1000F型酶标仪（上海闪谱生物科技有限公司）、SW-CJ-1FD型单人单面净化工作台（苏州净化有限公司）、TGL-16B型高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）、SKY-2112B型恒温摇床（上海苏坤实业有限公司）。1.2试验方法1.2.1产淀粉酶菌株的筛选取1 g土壤样品溶于9 mL生理盐水中，充分混匀，逐级梯度稀释，稀释后的样品100 μL均匀涂布于筛选固体培养基上，37 ℃培养1~2 d直至菌落长出。挑取生长情况较好的菌株点接种于筛选固体培养基上，待菌落长出，使用Lugols碘液进行染色，观察透明圈大小，选取最佳产酶菌株。1.2.2菌株的鉴定形态学鉴定：观察划线平板上菌落的形态，通过革兰氏染色，镜检观察菌体特征，根据《伯杰细菌鉴定手册》（第八版）对细菌进行初步鉴定。分子生物学鉴定：提取细菌基因组DNA，通过PCR扩增获取16S rDNA片段，由生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，在NCBI网站上使用BLAST与Genebank中已知的其他相似16S rDNA片段序列进行比对分析，通过软件Mega X使用邻接法（Neighbor-Joining method）构建系统发育进化树，对菌种进行鉴定。1.2.3淀粉酶的酶学特性分析1.2.3.1粗酶液的制备将筛选出的产淀粉酶菌株划线接种于固体培养基上，待菌落长出，挑取单菌落接种于液体种子培养基，37 ℃、180 r/min过夜培养，将种子发酵液以1%接种量接种于液体发酵培养基中，37 ℃、180 r/min培养14~16 h，发酵液12 000 r/min离心5 min，所获上清即为粗酶液。1.2.3.2酶活的测定绘制麦芽糖标准曲线，使用DNS法测定酶解后溶液中还原糖的含量，计算淀粉酶活力。淀粉酶活力定义：在一定pH值和温度条件下，每分钟水解1%淀粉溶液生成1 mg麦芽糖所需的酶量为一个酶活单位，用U表示。1.2.3.3最适反应温度在一定pH值条件下，将粗酶液与1%淀粉溶液混匀，分别在30、40、50、60、70、80 ℃条件下反应，测定酶活力，确定该淀粉酶的最适反应温度。1.2.3.4最适反应pH值在一定温度条件下，分别测定粗酶液在pH值为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0条件下的酶活力，确定该淀粉酶的最适反应pH值。1.2.3.5热稳定性将粗酶液分别在30、40、50、60、70、80 ℃条件下水浴30 min，测定剩余淀粉酶活力，分析该酶的热稳定性。1.2.3.6pH值稳定性将粗酶液分别在pH值为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0条件下处理30 min，测定剩余淀粉酶活力，分析该酶的pH值稳定性。1.2.3.7金属离子对淀粉酶活力的影响将粗酶液与0.1 mol/L的Na+、K+、Zn2+、Ca2+、Mn2+金属离子盐溶液按照1∶1的比例混匀，使金属离子盐溶液的终浓度为0.05 mol/L，测定此条件下的淀粉酶活力，以未加金属离子的反应体系作为对照，分析不同金属离子对酶活力的影响。1.2.4菌株的生长规律和产酶特点将种子发酵液按照1%的接种量接种到发酵液体培养基中，37 ℃、180 r/min培养，每2 h取样1次，测定菌液在600 nm处的吸光度以及菌液上清的淀粉酶活力，分析该菌的生长规律和产酶特点。2结果与分析2.1产淀粉酶菌株的筛选通过样品涂布初筛固体培养基，筛选出5株产淀粉酶菌株，产淀粉酶菌株的透明圈见图1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.19.017.F001图1产淀粉酶菌株的透明圈量取菌落直径（d）和透明圈直径（D），计算二者比值（D/d），产淀粉酶菌株透明圈直径与菌落直径的比值见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.19.017.T001表1产淀粉酶菌株透明圈直径与菌落直径的比值菌株名菌落直径（d）/mm透明圈直径（D）/mmD/dXT6193.17A9111.22B681.33C7131.86D6162.67E571.40由表1可知，选取比值最大的菌株XT进行后续分析研究。2.2菌株的鉴定菌株XT平板上菌落形态见图2（a）。由图2（a）可知，菌株XT开始呈乳白色，后期发黄、半透明、圆形、表面微皱或内凹。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.19.017.F002图2菌株XT的形态学特征（a）平板上菌落形态 （b）革兰氏染色后镜检革兰氏染色后镜检见图2（b）。由图2（b）可知，革兰氏阳性菌，菌体呈杆状，长约2 μm，芽孢中生或端生。将菌株XT 16S rDNA序列结果在NCBI网站上进行BLAST比对分析，菌株XT系统发育树见图3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.19.017.F003图3菌株XT系统发育树由图3可知，该菌与巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium EU918562.1）聚为一群，相似度达到99.93%，结合形态学特性，将菌株XT鉴定为巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium），命名为Bacillus megaterium XT（简称XT）。2.3菌株XT所产淀粉酶的酶学特性分析2.3.1菌株XT最适反应温度（见图4（a））由图4（a）可知，该菌所产淀粉酶的最适反应温度为50 ℃；在30和40 ℃条件下能够发挥约90%的酶活；当反应温度高于50 ℃，酶活力下降；在80 ℃条件下能够发挥83%的酶活。研究表明，该酶在低温和高温条件下均能够发挥一定的酶活力。2.3.2菌株XT最适反应pH值（见图4（b））由图4（b）可知，该菌所产淀粉酶的最适反应pH值为7.0；在pH值6.0和8.0均能发挥相对较高的酶活；在pH值3.0时仍能够发挥74%的酶活。研究表明，该酶在中性条件下能够发挥较高的酶活力。图4淀粉酶的最适反应条件10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.19.017.F4a1（a）菌株XT最适反应温度10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.19.017.F4a2（b）菌株XT最适反应pH值2.3.3菌株XT热稳定性（见图5（a））由图5（a）可知，该菌在30和40 ℃能够表现出较好的稳定性；处理30 min后残余酶活在80%以上；50 ℃以上处理30 min后，酶活下降50%以上；80 ℃处理30 min，残余18%的酶活。研究表明，菌株XT在高温条件下处理30 min后还能够发挥少量酶活力。2.3.4菌株XT的pH值稳定性（见图5（b））由图5（b）可知，该菌在中性条件下稳定性较好，酸性条件下稳定性较差；pH值8.0处理30 min，残余80%左右的酶活；pH值6.0处理30 min，残余63%的酶活。研究表明，该酶可以在中性和弱碱性条件下应用，但不适用于酸性条件，可以在动物肠道中充分发挥酶解作用，帮助动物消化吸收营养，而酶解后生成的小分子化合物，也能够发挥一定的益生元作用，从而稳固肠道有益微生态菌群[10-12]。图5淀粉酶的稳定性10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.19.017.F5a1（a）菌株XT热稳定性10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.19.017.F5a2（b）菌株XT的pH值稳定性2.3.5金属离子对淀粉酶活力的影响（见图6）不同金属离子对酶活力主要有两方面的影响：激活作用和抑制作用。由图6可知，菌株XT所产淀粉酶的活力可以被Na+、K+和Ca2+激活，而Mn2+和Zn2+对酶活力具有抑制作用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.19.017.F006图6金属离子对淀粉酶活力的影响注：数据柱标注不同小写字母表示差异显著（P0.05）。2.3.6菌株XT的生长和产酶规律（见图7）由图7可知，该菌在0~4 h生长较缓慢，此时期为迟缓期；4~14 h期间，菌株迅速生长繁殖，菌体密度增长较快，呈对数生长状态，此时期为对数期；14~22 h期间，菌体数量较稳定，并呈现微弱的下降趋势，此时期为稳定期，逐步进入衰亡期；22~24 h可见菌体数目下降，大量菌体生长代谢所需营养不能得到充足的供应，代谢过程中的各种产物对菌体的生长产生一定的抑制作用，菌体量将会大幅度减少。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.19.017.F007图7菌株XT的生长和产酶规律由图7的产酶曲线可知，菌株XT的产酶稍落后于菌体的增殖。在菌体生长对数期开始2 h后，酶活开始逐步提高，说明此时菌体开始大量分泌淀粉酶；当菌体生长到达稳定期后，上清中淀粉酶活力达到最高值6.18 U/mL；在稳定期后期，酶活开始下降，说明该菌株所分泌的淀粉酶的活性一方面受到菌体活力的影响，另一方面受到菌体代谢产物的影响。因此，应于稳定期对该菌所产淀粉酶进行收获。3讨论土壤中含有一定量源自动植物残骸、风化岩石的有机质和矿物质以及各种降解利用该类物质的微生物[13-14]。因此，土壤是常用的筛菌样品。饲料中淀粉的高效利用能够起到节约能量饲料和降低饲料成本的作用，酶解淀粉能够使肠道食糜黏度降低，产生的小分子物质还能够发挥益生元的作用[12]，维护肠道以及动物体健康。因此，淀粉酶在饲料业和畜牧业中具有非常重要的价值[15-16]。淀粉酶在畜牧业中能够改善单胃动物对饲料的利用率。淀粉酶添加在断奶仔猪日粮中，能够改善动物消化功能并提高机体免疫力[17]。淀粉酶能够通过改善青贮饲料的品质提高反刍动物的生产性能。研究发现，淀粉酶能够提高青贮发酵产物的水溶性碳水化合物、乳酸和乙酸的产量，从而改善青贮发酵品质[18]。本研究中，筛选到的产酶菌为巨大芽孢杆菌，该菌是1种具有良好抗逆性的益生菌。芽孢杆菌具有较好的产酶、产活性肽类的特性[19]。研究发现，芽孢杆菌发酵饲料还能够改善水产动物的体色，提高其经济价值[20]。该菌所产淀粉酶的最适反应条件为50 ℃、pH值7.0，虽然与大多数淀粉酶类似[21]，但是该菌在弱碱性条件下稳定性较好，对其进行适当包被过胃后能够在肠道弱碱性环境中发挥作用。在产酶功能菌的筛选过程中，除了要分析所产酶的特性外，对菌株本身的生长特点和产酶特点的研究也很重要。通过对菌株生长产酶特点进行分析，可以掌握发酵生产过程中的最佳收获时间点，从而降低成本。本研究结果表明，在生长稳定期淀粉酶的活力较高，因此可在稳定期对淀粉酶进行收获。不同的培养条件也会影响菌株的最佳发酵时间。有研究对筛选到的蜡状芽孢杆菌的发酵条件进行优化，结果发现，发酵24 h所产淀粉酶活力最高[22]。也有研究通过响应面法对贝莱斯芽孢杆菌产淀粉酶进行优化，结果表明，发酵时间4 d时产酶能力较强[6]。4结论本研究表明，巨大芽孢杆菌最适反应条件为50 ℃、pH值7.0，在中低温条件下以及中性和弱碱性条件下稳定性较好，Na+、K+和Ca2+对酶活力具有激活作用，而Mn2+和Zn2+对酶活力具有抑制作用，该菌在生长稳定期，上清酶活最高。因此，可在14~16 h对淀粉酶进行收获。