我国是农业大国，每年产生大量的农业副产品，如小麦秸秆等。但是，这些小麦秸秆常被当成农业废弃物处理[1]。合理利用这些有机废弃物可以带来经济效益和生态效益[2]。小麦秸秆的主要成分是木质纤维素，利用小麦秸秆部分替代动物饲料成为目前研究的热点。目前，秸秆预处理方法包括物理法、化学法和生物法等。其中，生物法以其具有环保的特点受到研究人员的关注[3]。在小麦秸秆预处理中，木质素的降解是急需解决的问题，而白腐真菌能够将木质素降解为CO2和H2O[4]。但是，白腐真菌对有机废弃物的预处理会受到多种因素的影响，如真菌种类、培养基成分和培养条件等[5]。漆酶（EC 1.10.3.2）广泛存在于高等植物、真菌、细菌、昆虫和地衣中，特别是在许多参与木质素代谢的白腐真菌中[6]。漆酶可以通过生物转化将木质纤维素基质转化为可消化饲料[7]。漆酶具有底物专一性和多功能性，能够利用分子氧作为最终电子受体，受到环境生物技术和工业界的高度关注[8]。本研究旨在筛选能够很好利用小麦秸秆产漆酶的白腐真菌，优化产漆酶的培养条件，提高发酵过程中酶的分泌效率以提高饲料消化率，从而提高动物饲料的价值。1材料与方法1.1试验材料1.1.1菌种木蹄层孔菌（Fomes fomentarius）、侧耳（Pleurotus ostreatus）、白囊耙齿菌（Irpex lacteus）、彩绒革盖菌（Coriolus versicolor）、一色齿毛菌（Cerrena unicolor）、裂蹄木层孔菌（Phellinus linteus）、香栓菌（Trametes suaveloens）、火木层孔菌（Phellinus igniarius）、裂褶菌（Schizophyllum commune）采自东北林业大学帽儿山林场，4 ℃保存于北方民族大学生物化学实验室。1.1.2试验材料小麦秸秆采自宁夏农林科学院农作物研究所永宁王太试验基地。1.1.3试验试剂琼脂、蛋白胨、酵母浸粉、胰蛋白胨、蔗糖、葡萄糖（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；愈创木酚、硫胺素、K2HPO4、MgSO4、CaCl2、MnSO4、NaCl、CaSO4·H2O、Na2MoO4·2H2O、FeSO4·7H2O、CoCl2、CuSO4、KAl(SO4)2·12H2O、H3BO3、ZnSO4·7H2O、硫酸铵、酒石酸铵、柠檬酸、柠檬酸钠试剂均为分析纯（北京索莱宝科技有限公司）；琥珀酸二甲酯、NTA试剂均为分析纯（西格玛奥德里奇贸易有限公司）。1.1.4仪器设备超净工作台（SW-CJ-1FD，苏州安泰空气技术有限公司）、生化培养箱（LRH250，上海一恒科学仪器有限公司）、台式高速冷冻离心机（3-30K，希格玛离心机公司）、高压灭菌锅（LDZX-50KBS，上海申安医疗器械厂）、恒温水浴锅（北京长源实验设备厂）、紫外可见分光光度计（UV1000，上海天美科学仪器有限公司）、电子分析天平（JH502，海精密科学仪器有限公司）。1.1.5培养基木屑麦麸培养基：20%麦麸、78%白桦木屑、1% CaSO4·H2O、1%蔗糖。PDA固体培养基：马铃薯200 g/L、琼脂20 g/L、葡萄糖20 g/L。愈创木酚-PDA固体培养基：愈创木酚0.04%、马铃薯200 g/L、琼脂20 g/L。愈创木酚-小麦秸秆固体培养基：愈创木酚0.04%、小麦秸秆10 g/L、琼脂20 g/L。基础培养基：参考Tien等[9]培养基配方。1.2试验方法1.2.1菌种活化将保存于木屑麦麸培养基中的白腐真菌接种到PDA固体培养基，28 ℃避光培养，直至菌丝长满培养皿，4 ℃保存备用。1.2.2初筛和复筛取6 mm活化的菌饼接种到愈创木酚-PDA固体培养基中心，28 ℃避光培养6 d，通过比较菌落和水解圈直径大小筛选高产漆酶的白腐真菌，将初筛得到的白腐真菌取6 mm活化的菌饼接种到愈创木酚-小麦秸秆固体培养基，筛选能够利用小麦秸秆高产漆酶的白腐真菌。1.2.3产漆酶培养条件的优化1.2.3.1酶活曲线将2个6 mm的菌饼接种至含有15 mL基础培养基的100 mL锥形瓶中，28 ℃避光静置培养，每2 d测定漆酶酶活。1.2.3.2培养基初始pH值将2个6 mm的菌饼接种至初始pH值分别为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0和7.0的基础培养基中，28 ℃避光静置培养，于产酶的高峰期测定漆酶酶活。1.2.3.3培养温度将2个6 mm的菌饼接种至最适初始pH值的基础培养基中，分别在22、25、28、31和34 ℃避光静置培养，于产酶的高峰期测定漆酶酶活。1.2.3.4碳源添加量将2个6 mm的菌饼接种至最适初始pH值且小麦秸秆添加量分别为10、15、20、25、30和35 g/L的基础培养基中，最适培养温度避光静置培养，于产酶的高峰期测定漆酶酶活。1.2.3.5氮源种类将2个6 mm的菌饼接种到最适初始pH值、最佳碳源添加量且含有0.2 g/L蛋白胨、酵母浸粉、胰蛋白胨、硫酸铵、酒石酸铵和大豆粉的基础培养基中，最适培养温度避光静置培养，于产酶的高峰期测定漆酶酶活。1.2.3.6氮源浓度将2个6 mm的菌饼接种到最适初始pH值、最佳碳源添加量且最佳氮源浓度分别为0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 g/L的基础培养基中，最适培养温度避光静置培养，于产酶的高峰期测定漆酶酶活。1.2.3.7正交试验综合单因素试验的结果，进行L9（34）正交试验，分别对不同因素、不同水平组合的产漆酶酶活水平进行测定，得到最优组合。1.2.4粗酶液制备取液体培养基，4 ℃、10 000 r/min离心10 min，上清液即为粗酶液。1.2.5漆酶活性测定取0.05 mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（pH值3）2.3 mL、1.0 mmol/L ABTS 0.2 mL、适当稀释的粗酶液0.5 mL，测定30 ℃、波长420 nm处1 min内吸光度的变化。漆酶的酶活力定义：每分钟催化1 μmol底物所消耗掉的酶量为1个酶活性单位，即1 U。2结果与分析2.1初筛和复筛2.1.1产漆酶白腐真菌的初筛（见表1）由表1可知，经过愈创木酚-PDA固体培养基的初筛，一色齿毛菌、白囊耙齿菌、侧耳和彩绒革盖菌生长较快，且脱色圈直径较大。其中一色齿毛菌和白囊耙齿菌生长最快，且第6 d脱色圈直径分别达到7.61和7.54 cm，R/r分别分为1.18和1.19。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.19.016.T001表1产漆酶白腐真菌的初筛菌株第2 d第4 d第6 d菌落直径（R）/cm脱色圈直径（r）/cmR/r菌落直径（R）/cm脱色圈直径（r）/cmR/r菌落直径（R）/cm脱色圈直径（r）/cmR/r一色齿毛菌2.922.521.166.536.271.049.007.611.18白囊耙齿菌2.222.131.046.645.881.139.007.541.19彩绒革盖菌2.541.911.334.333.521.236.285.831.08侧耳2.151.641.314.714.531.047.026.921.01火木层孔菌2.331.921.213.853.431.124.644.171.11木蹄层孔菌1.761.331.323.763.131.205.063.641.39香栓菌1.440.751.923.232.681.214.733.551.33裂蹄木层孔菌0.900—1.710—3.572.781.28裂褶菌1.340—3.450—5.723.021.89注：“—”表示无脱色圈，无法计算该值；下表同。2.1.2产漆酶白腐真菌的复筛（见表2）由表2可知，经过愈创木酚-小麦秸秆固体培养基对初筛得到的菌株进行复筛，一色齿毛菌和白囊耙齿菌的长势及水解能力相对较好。第6 d时，一色齿毛菌脱色圈直径为8.72 cm，比白囊耙齿菌的脱色圈直径大0.49 cm，故选择一色齿毛菌进行后续试验。对4种菌株的复筛和初筛脱色圈直径进行比较，发现以小麦秸秆作为唯一营养源白腐真菌产生的脱色圈直径大于PDA上产生的脱色圈直径。因此，小麦秸秆更有利于白腐真菌产漆酶。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.19.016.T002表2产漆酶白腐真菌的复筛菌株第2 d第4 d第6 d菌落直径（R）/cm脱色圈直径（r）/cmR/r菌落直径（R）/cm脱色圈直径（r）/cmR/r菌落直径（R）/cm脱色圈直径（r）/cmR/r一色齿毛菌2.732.731.006.456.451.009.008.721.03白囊耙齿菌2.442.211.106.576.181.069.008.231.09彩绒革盖菌2.431.951.256.025.611.077.977.761.03侧耳1.911.621.185.864.871.207.807.111.102.2产漆酶培养条件优化2.2.1一色齿毛菌产漆酶酶活曲线（见图1）由图1可知，一色齿毛菌产漆酶的活性随时间延长呈现先升后降的趋势，在培养第6 d达到最高峰，酶活为1.09 U/mL。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.19.016.F001图1一色齿毛菌产漆酶酶活曲线2.2.2培养基初始pH值对一色齿毛菌产漆酶的影响（见图2）由图2可知，一色齿毛菌在培养基初始pH值为3.0时，漆酶酶活最大为1.37 U/mL，pH值为2.0时漆酶酶活性极低。在不同的培养基初始pH值测的漆酶酶活差异显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.19.016.F002图2培养基初始pH值对一色齿毛菌产漆酶的影响注：图中不同字母不同表示差异显著（P0.05），字母相同表示差异不显著（P0.05）；下图同。2.2.3培养温度对一色齿毛菌产漆酶的影响（见图3）由图3可知，随着培养温度的升高，一色齿毛菌产漆酶酶活先增大后降低，且在28 ℃时酶活达到最大，为1.95 U/mL，34 ℃时漆酶酶活显著低于其他温度（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.19.016.F003图3培养温度对一色齿毛菌产漆酶的影响2.2.4碳源添加量对一色齿毛菌产漆酶的影响（见图4）由图4可知，随着碳源添加量的增加，一色齿毛菌产漆酶酶活先增加后降低，且在碳源添加量为25 g/L时酶活达到最大，为2.47 U/mL。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.19.016.F004图4碳源添加量对一色齿毛菌产漆酶的影响2.2.5氮源种类对一色齿毛菌产漆酶的影响（见图5）由图5可知，当氮源为酵母浸粉时，一色齿毛菌产漆酶酶活最大，为3.37 U/mL。除大豆粉和硫酸铵外，氮源种类对一色齿毛菌产漆酶酶活性影响显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.19.016.F005图5氮源种类对一色齿毛菌产漆酶的影响2.2.6氮源浓度对一色齿毛菌产漆酶的影响（见图6）如图6可知，随着氮源浓度的增加，一色齿毛菌产漆酶酶活先增大后降低，且氮源浓度为1.5 g/L时酶活达到最大，为5.54 U/mL。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.19.016.F006图6氮源浓度对一色齿毛菌产漆酶的影响2.2.7正交试验根据单因素试验的结果，选择温度、初始pH值和氮源浓度进行L9（34）正交试验。正交试验因素与水平设计见表3。正交试验设计和结果见表4。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.19.016.T003表3L9（34）正交试验因素与水平设计水平A温度/℃B初始pH值C氮源浓度/(g/L)D空白1252.51.012283.01.523313.52.0310.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.19.016.T004表4L9（34）正交试验设计和结果项目ABCD漆酶酶活/(U/mL)111113.13212227.71313333.32421236.83522316.51623124.16731323.59832134.63933214.19k14.724.523.974.61k25.836.286.245.15k34.143.894.474.93R1.702.392.270.54由表4可知，一色齿毛菌在液体发酵培养基培养条件下，最优产漆酶组合为A2B2C2，即酵母浸粉1.5 g/L、培养基初始pH值3、培养温度28 ℃。正交试验方差分析见表5。由表5可知，影响一色齿毛菌产漆酶酶活的主次因素为初始pH值氮源浓度温度。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.19.016.T005表5正交试验方差分析因素偏差平方和自由度均方F值显著性温度4.4622.239.94pH值9.2424.6220.68*氮源浓度8.5424.2719.10*误差0.452注：1.F0.01(2,2)=99，F0.05(2,2)=19。2.*表示影响显著（P0.05）。对最优产漆酶组合A2B2C2进行3次平行验证试验，得到漆酶酶活平均值为7.94 U/mL，证明此组合为最适产酶条件。3讨论漆酶大多为诱导型酶，漆酶的合成和分泌受培养条件、发育阶段以及多种诱导物的影响[10]。通过优化产漆酶的培养条件、提高培养基中的C/N比、与一些真菌进行共培养等方法均可以显著提高漆酶的分泌[11-12]。氮源种类研究中发现，酵母浸粉是一色齿毛菌产漆酶很好的氮源，与革耳[13]、毛栓菌[14]和糙皮侧耳[15]的氮源筛选结果一致。与其他研究结果相比，本试验一色齿毛菌的最佳培养基初始pH值并没有位于5.0~6.7之间[16-18]，而初始pH值为3.0，并且pH值为4.0时酶活开始显著下降。小麦秸秆的添加量在一定范围内能够促进一色齿毛菌产漆酶，但是小麦秸秆的添加量超过25 g/L时，碳源添加量继续增加，漆酶酶活有所降低。徐安民等[17]在毛木耳5.584产漆酶的研究中也发现，不同质量浓度的麸皮对毛木耳产漆酶酶活有显著影响，当麸皮质量浓度≥40 g/L时，漆酶酶活开始降低，与本研究结果相似，说明过多的生物质资源并不一定有利于白腐真菌产漆酶。李小凤等[13]研究野生革耳（Panus rudis）产漆酶，发现漆酶最大酶活为4.59 U/mL。周孟清等[19]利用6种食用菌分别降解小麦秸秆，发现第7 d时，云芝产漆酶酶活最高为2.23 U/mL，而本试验筛选到的一色齿毛菌，优化后降解小麦秸秆产漆酶的酶活可以达到7.71 U/mL，显示出很好的产漆酶优势，具有进一步研究的价值。4结论将一色齿毛菌利用小麦秸秆液体发酵产漆酶的培养条件进行单因素和正交试验优化，得到最佳培养条件：培养基初始为pH值3.0，最适氮源为酵母浸粉，最佳氮源浓度为1.5 g/L，小麦秸秆添加量为25 g/L，最佳培养温度为28 ℃，第6 d产酶量最大。一色齿毛菌产漆酶的酶活由最初的1.09 U/mL提高至7.94 U/mL，较优化前提高7.28倍。