饲料原料在生产之前需要提前储备，其新鲜度、营养成分、霉菌生长情况易受存储温度、相对湿度及时间的影响[1]。乳清粉价格昂贵、饲料用量占比较少，饲料生产厂家一般采用批量采购的方式。同时，饲料用量占比较少，使原料使用周期和厂内仓库储存时间较长，一般可达3~4个月。乳清粉是产自干燥乳清或酸乳清的产品，主要成分为乳糖、乳蛋白、水溶性维生素和矿物质等，可以为动物提供能量，维持消化道适当酸度，提供易消化蛋白质，提高饲料适口性等[2-6]。乳清粉在生产储存过程中易发生美拉德反应[7-9]。美拉德反应可以使乳清粉具有独特风味，但从营养学角度考虑，美拉德反应会损耗乳清粉中乳糖和乳蛋白等有效成分，降低营养价值[10]，甚至可能产生有害产物，如5-羟甲基糠醛（5-HMF）[11-12]、晚期羰基化终末产物（AGEs）[13-14]、丙烯酰胺[15]、α-二羰基化合物等[16]。此外，乳清粉易吸潮、乳糖含量高、易生长霉菌，进而影响动物的生长和健康。本试验拟选取乳清粉作为储存研究对象，模拟环境储存条件，研究不同环境条件下乳清粉营养成分、美拉德反应程度及霉菌数量随储存时间延长的变化规律，为乳清粉的储存及原料流转率提供参考。1材料与方法1.1仪器与试剂LHH-250GSD恒温恒湿箱（上海一恒科学仪器有限公司）、CM-5分光测色仪（日本柯尼卡美能达）、DZ-2BL真空干燥箱（黄骅菲斯福实验仪器有限公司）、AE240分析天平（上海梅特勒-托利多国际贸易有限公司）、SB-3200DT超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）、SHB-3循环水式多用真空泵（巩义市英峪华科仪器厂）、HY-2A多用调速振荡器（江苏金怡仪器科技有限公司）、IMS-150全自动雪花制冰机（常熟市学科电器有限公司）、DHG-9123A电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）、HWS-12电热恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司）、1260 Infinity Ⅱ高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）、S433D氨基酸分析仪（北京赛卡姆科学仪器有限公司）。高纯氮、真空干燥器（Φ400 mm）、一次性过滤器（1 mL、5 mL）、有机相针式滤器（Φ13 mm，0.22 μm，尼龙）、水相针式滤器（Φ13 mm，0.22 μm，聚醚砜）、水相过滤膜（Φ50 mm，0.45 μm）、有机相过滤膜（Φ50 mm，0.45 μm）、定性滤纸（快速，Φ12.5 cm）、砂芯过滤装置（1 L）、牛皮纸包装袋（内置塑料内膜，30 cm×45 cm）。乳清粉，饲料级；乙酸锌，分析纯（天津市科密欧化学试剂有限公司）；亚铁氰化钾，分析纯（天津市致远化学试剂有限公司）；草酸、苯酚、乙醇，均为分析纯（成都市科隆化学品有限公司）；乙腈、甲醇，均为色谱纯（北京迈瑞达科技有限公司）；异丙醇，色谱纯（西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司）；盐酸，优级纯（成都市科隆化学品有限公司）；二水合柠檬酸三钠、柠檬酸、氢氧化钠、硼酸、EDTA、三水合乙酸钠、乙酸钾、乙酸，均为分析纯（广东光华科技股份有限公司）；茚三酮，分析纯（赛卡姆（北京）科学仪器有限公司）；抗坏血酸，优级纯（天津市科密欧化学试剂有限公司）；硫二甘醇、乳糖标准品、5-羟甲基糠醛标准品，纯度≥99%（西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司）。1.2试验方法1.2.1模拟乳清粉储存条件模拟商品乳清粉包装袋，即采用塑料内膜加牛皮纸外包装的方式，将已购乳清粉按照5 kg每袋分装，共分装9袋。将分装后的9袋乳清粉随机分为3组，分别放入温度为35 ℃，相对湿度为45%、65%、85%的恒温恒湿箱中，模拟进行乳清粉储存试验。1.2.2乳清粉品质的相关指标测定乳清粉品质的变化主要由乳清粉中乳糖与其所含的蛋白质发生美拉德反应及霉菌生长而导致。因此，本研究拟将乳清粉美拉德反应程度（指标如水分含量、乳糖含量、色度、溶解性、美拉德反应产物）和霉菌生长情况（指标如霉菌总数等）作为重点研究内容，建立乳清粉美拉德反应程度的评价方案，研究不同温湿度条件下乳清粉品质随时间的变化规律。1.2.2.1乳清粉中水分含量的测定乳清粉中水分含量的测定根据GB/T 6435—2014《饲料中水分的测定》中8.2减压干燥法进行。1.2.2.2乳清粉中乳糖含量的测定乳清粉中乳糖含量的测定参考GB 5413.5—2010《食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中乳糖、蔗糖的测定》，即称取固态试样约0.15 g（精确至0.000 1 g）于100 mL容量瓶中，加入约80 mL 50%的乙腈水溶液，超声提取30 min，使用纯水定容至刻度，静置数分钟，采用一次性过滤器将提取液通过0.22 μm水相针式滤器过滤，滤液供色谱分析。液相色谱条件：色谱柱，氨基柱4.6 mm×250 mm，5 μm；流动相，乙腈∶水为70∶30；流速，1 mL/min；柱温，35 ℃；进样量，10 μL；示差折光检测器条件，温度35 ℃。1.2.2.3乳清粉色度的测定乳清粉色度采用色度仪测定。色度仪中L*代表明度指数，+表示偏白，－表示偏暗；a*表示红绿，+表示偏红，-表示偏绿；b*表示黄蓝，+表示偏黄，－表示偏蓝。样品颜色总色差△E*=（△L*2＋△a*2＋△b*2）1/2，其中：△L*=L*褐变－L*原始，△a*=a*褐变－a*原始，△b*=b*褐变－b*原始。总色差△E*值越大，代表储存过程中乳清粉与初始状态乳清粉色差越大，乳清粉褐变越显著。1.2.2.4乳清粉中赖氨酸含量的测定乳清粉中赖氨酸含量的测定根据GB/T 18246—2019《饲料中氨基酸的测定》中3常规酸水解法进行。1.2.2.5乳清粉中5-HMF含量的测定乳清粉中5-HMF含量的测定根据NY/T 1332—2007《乳与乳制品中5-羟甲基糠醛含量的测定 高效液相色谱法》进行。1.2.2.6乳清粉中霉总的测定乳清粉中霉总的测定根据GB/T 13092—2006《饲料中霉菌总数的测定》进行。2结果与分析2.1不同环境湿度下乳清粉颜色及色度随储存时间的变化（见图1）乳清粉储存过程中，随着储存时间的延长，乳清粉的颜色逐渐加深；环境相对湿度越大，乳清粉褐变越明显。乳清粉颜色褐变表明其成分发生美拉德反应，这种反应可能贯穿整个乳清粉储存过程。为进一步研究乳清粉在储存过程中色度的变化情况，采用色度仪对各组乳清粉的色度进行测定。由图1可知，随着储存时间的延长，乳清粉a*值和b*值均逐渐增大；环境相对湿度越高，乳清粉a*值和b*值越高；随着储存时间的延长，乳清粉L*值逐渐减小；环境相对湿度越高乳清粉L*值降低越快。根据各储存时间L*值、a*值、b*值计算样品储存过程中的总色差。结果表明，随着储存时间的延长，乳清粉总色差△E*值逐渐增大，并且环境相对湿度越高总色差△E*越大，这也与乳清粉表观颜色变化情况一致。高温环境储存的乳清粉会发生褐变，储存时间越长，褐变越显著；储存过程中环境相对湿度的增加会加剧乳清粉的褐变。图1不同环境湿度下乳清粉颜色及色度随储存时间的变化10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.19.019.F1a1（a）储存过程中乳清粉a*值的变化10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.19.019.F1a2（b）储存过程中乳清粉b*值的变化10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.19.019.F1a3（c）储存过程中乳清粉L*值的变化10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.19.019.F1a4（d）储存过程中乳清粉总色差△E*的变化2.2不同环境湿度下乳清粉水分含量随时间的变化（见图2）环境相对湿度增大会加剧乳清粉褐变程度，其本质可能是环境相对湿度影响乳清粉中的水分含量，而水分含量的变化在一定程度上影响美拉德反应速度[17-18]。因此，研究高温条件、不同环境温湿度条件下，乳清粉储存过程中水分含量的变化。由图2可知，相同温度下乳清粉水分含量随环境相对湿度的增加而增大。随着储存时间的延长，样品中的水分含量逐渐增大，至储存后期趋于平缓。整个储存过程中，环境相对湿度对样品中水分含量的影响可能是缓慢的逐渐平衡过程。到达一定程度后，则空气中的水分子和乳清粉中的水分子处于平衡状态。同时，对比图2和图1（d）可知，乳清粉总色差的变化趋势与乳清粉中水分含量的变化趋势相同，表明水分含量对乳清粉褐变有一定影响。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.19.019.F002图2不同环境湿度下乳清粉水分含量随时间的变化2.3不同环境湿度下乳清粉乳糖含量随时间的变化（见图3）由图3可知，储存过程中乳清粉中乳糖的含量未发生明显变化，基本处于77%~83%之间。乳清粉褐变过程中，可能因为参与美拉德反应的乳糖含量较少，相比乳清粉自身高达约78%含量来说基数很低，乳清粉在储存过程中乳糖含量的变化不显著。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.19.019.F003图3不同环境湿度下乳清粉乳糖含量随时间的变化2.4不同环境湿度下乳清粉赖氨酸含量随时间的变化（见图4）有研究表明，引起美拉德反应速度由高到低依次为：胺、氨基酸和蛋白质，其中氨基酸常被用作美拉德反应的底物[8]。氨基酸中的ε-氨基或末位氨基比α-氨基反应速率快，碱性氨基酸的美拉德反应速率比中性或酸性氨基酸快，以L-赖氨酸最为突出[19]。本研究将含有ε-氨基基团的赖氨酸含量作为反映美拉德反应程度的指标之一。由图4可知，环境温度35 ℃、不同环境相对湿度（45%、65%、85%）存储条件下，乳清粉中赖氨酸的含量随着储存时间的延长均呈显著下降趋势，最低下降量约占初始含量的58%，下降量约0.026%。环境相对湿度越大，乳清粉中赖氨酸含量下降越明显，环境相对湿度最高。试验组乳清粉的赖氨酸含量由0.048%下降至0.016%，比初始含量降低约67%。环境相对湿度的增加促进乳清粉中赖氨酸的损耗，加快乳清粉美拉德反应速率，即促进了乳清粉的褐变。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.19.019.F004图4不同环境湿度下乳清粉赖氨酸含量随时间的变化2.5不同环境湿度下乳清粉5-HMF含量随时间的变化（见图5）5-HMF是美拉德反应的一类产物，主要由氨基化合物与乳糖的羰基发生一系列反应形成。乳糖的异构化作用和降解作用也可形成5-HMF[20]。因此，5-HMF在一定程度上可以反映美拉德反应程度。由图5可知，不同存储条件下，随着存储时间的延长，各组乳清粉中5-HMF含量均先增加，从初始含量18.18 mg/kg上升至约300.00 mg/kg，最高可以达400.00 mg/kg，储存至一定时间后乳清粉中5-HMF含量开始降低。对比不同环境相对湿度条件可发现，在较高的环境相对湿度（即环境相对湿度85%）下，乳清粉中5-HMF含量增加速度较快，并且在储存至83 d时含量达到最高点，随后随着储存时间的延长乳清粉中5-HMF含量开始下降；在相对较低的环境相对湿度（即环境相对湿度45%、65%）时，乳清粉中5-HMF含量增速先缓慢后较快，并且在储存至97 d时含量达到最高点；随后随着储存时间的延长乳清粉中5-HMF含量开始下降。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.19.019.F005图5不同环境湿度下乳清粉5-HMF含量随时间的变化从反应底物赖氨酸的变化趋势推测（见图4），在整个储存过程中，乳清粉中赖氨酸含量均呈降低趋势，表明美拉德反应在整个储存过程中持续进行，相对湿度越高，赖氨酸含量下降越明显，美拉德反应越剧烈。储存后期5-HMF含量呈下降状态可能是：5-HMF反应性质较为活泼，随着储存前期5-HMF产物的累积，5-HMF进一步发生醛酮缩合反应而产生无氮醛酮化合物或晚期糖基化终末产物等。2.6乳清粉储存过程中霉菌总数的变化环境相对湿度的变化可以使乳清粉内水分含量发生变化，储存温度高、乳清粉营养丰富等条件，为霉菌的生产创造一定条件。因此，研究储存过程中乳清粉中霉菌总数的生长情况。当环境相对湿度为45%和65%时，乳清粉中霉菌总数在储存过程中（储存114 d）均小于50 CFU/g，符合NY/T 1563—2007《饲料级 乳清粉》中3.3技术指标霉菌总数≤50 CFU/g的要求；而当环境相对湿度85%时，乳清粉储存60 d后，部分样品组霉菌总数开始大于50 CFU/g，并且在储存第90 d后所有样品组均出现霉菌总数大于50 CFU/g的情况（最高霉菌总数达150 CFU/g）。因此，环境相对湿度较高利于乳清粉中霉菌的生长。3讨论乳清粉在高温（35 ℃）存储过程中会发生褐变（即发生美拉德反应），环境相对湿度越高褐变越明显。环境相对湿度的增加使得乳清粉中水分含量升高，在一定程度上也加速了乳清粉的褐变。储存环境的变化及储存时间的延长不会对乳清粉中乳糖的含量有显著影响，但乳清粉储存过程中，赖氨酸含量显著降低，最低下降量约占初始含量的58%，下降量约0.026%。结果表明，在储存过程中，乳清粉中参与美拉德反应的底物量较少。乳清粉高温（35 ℃）储存过程中，美拉德反应中间产物5-HMF含量先增加，后随着美拉德反应的进一步发生，5-HMF参与美拉德最终反应而减少。环境相对湿度越高，美拉德反应越快速进入最终阶段反应，产生的有害产物可能增多和累积。较低的环境相对湿度（65%）下，储存时间的增加对高温储存的乳清粉中霉菌总数无显著影响；而在高温（35 ℃）和环境相对湿度（85%）较高的条件下，储存时间的延长会使乳清粉中霉菌总数增加，乳清粉的储存时间不能超过2个月。4结论乳清粉在高温储存条件下，乳糖含量不会发生显著变化，但在储存过程中会发生褐变，仓库储存时应控制环境相对湿度，避免乳清粉水分含量和霉菌总数的增加。同时应控制储存时间不超过2个月，避免美拉德反应最终有毒产物的大量累积，影响动物健康。