蛋白质饲料资源短缺是制约我国畜牧业健康持续发展的重要因素，开发新型、可再生的蛋白质饲料资源迫在眉睫[1]。昆虫幼虫蛋白质含量高、必需氨基酸种类和含量与畜禽营养需要接近。因此，昆虫幼虫成为开发潜力巨大的新型蛋白质饲料资源[2-6]。亮斑扁角水虻是食腐性昆虫，幼虫阶段取食广泛、生物转化快、预蛹营养价值高[7-10]。亮斑扁角水虻幼虫粉（BSFLM）的粗蛋白质含量为40%~48%，粗脂肪含量为25%~40%，富含氨基酸和矿物质元素[11-12]。研究表明，在畜禽和水产饲料中采用BSFLM替代豆粕或鱼粉均取得了较好的效果[13-16]。育雏期（0~35日龄）是蛋鸡生长发育的关键阶段，育雏期蛋鸡生长性能和肠道的健康程度直接影响后期蛋鸡的产蛋性能。BSFLM富含蛋白质和脂肪，含有具有杀菌作用的月桂酸和调节免疫机能的壳聚糖[17-18]。目前，关于BSFLM对育雏期蛋鸡生产性能和肠道健康的研究较少。因此，本试验通过研究饲粮中添加不同比例BSFLM对蛋雏鸡生长性能、肠道黏膜的组织学结构及紧密连接蛋白相关基因表达量的影响，为BSFLM的推广和应用提供参考。1材料与方法1.1亮斑扁角水虻幼虫粉选用3龄期（5日龄）亮斑扁角水虻幼虫，采用餐厨垃圾（聊城大学食堂）在28 ℃条件下饲养10 d，分离活虫，清洗消毒和微波烘干（FD-5，江苏常州力诺干燥工程有限公司）。风干样品经聊城大学动物营养与饲料分析实验室检测分析，粗蛋白质、粗脂肪、粗灰分、蛋氨酸和赖氨酸含量分别为41.36%、31.82%、2.94%、0.61%和2.15%。1.2试验动物与分组选取当日孵化的海兰褐商品代健康蛋雏鸡480只，随机分为4组（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组），每组6个重复，每个重复20只蛋雏鸡，试验Ⅰ组为对照组。试验日粮中分别添加0、3%、6%和9%的BSFLM，根据中国2012年鸡饲养标准（NY/T 33—2012），按照“等能等蛋”配制饲料。试验日粮组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.19.014.T001表1试验日粮组成及营养水平（风干基础）项目Ⅰ组Ⅱ组Ⅲ组Ⅳ组原料组成/%玉米66.7666.5865.4166.06豆粕26.2524.2622.7720.23玉米蛋白粉2.001.361.000亮斑扁角水虻幼虫粉03.006.009.00豆油1.160.820.560.45石粉1.131.291.451.45磷酸氢钙1.491.481.701.70L-赖氨酸盐酸盐（98%）0.100.1000DL-蛋氨酸0.110.110.110.11预混料1.001.001.001.00合计100.00100.00100.00100.00营养水平代谢能/(MJ/kg)12.6012.6012.6212.60粗蛋白质/%20.1120.1520.1820.32钙/%1.011.011.031.03非植酸磷/%0.460.460.460.46赖氨酸/%1.151.151.151.15蛋氨酸/%0.440.440.440.44注：1.预混料为每千克日粮提供：Cu 6.8 mg、Fe 66 mg、Zn 83 mg、Mn 80 mg、I 1 mg、Se 0.30 mg、VA 11 700 IU、VD3 3 600 IU、VE 21 IU。2.营养水平中代谢能、赖氨酸和蛋氨酸为计算值，其余均为实测值。1.3饲养管理2019年11月11日~12月16日在聊城大学农业生态园进行饲养试验，采用笼养方式，日常管理按照鸡场常规进行。试验期间记录每天喂料量，观察雏鸡健康状况。1.4测定指标及方法1.4.1生长性能鸡饲养至35日龄，禁食12 h，以重复为单位对鸡群称重，分别计算平均日增重（ADG)、平均日采食量（ADFI）和料重比（F/G）；用游标卡尺测定胫骨长度。平均日增重=(末重-初重)/饲养天数(1)平均日采食量=总饲料喂食量/饲养天数(2)料重比=总饲料喂食量/(末重-初重)(3)1.4.2肠道形态结构的测定蛋雏鸡35日龄，每个重复随机选取1只鸡，颈静脉放血，致死，解剖，剪取空肠和回肠，经“甲醛固定-石蜡切片-苏木精-伊红染色”等制作切片，光镜下观察，对肠绒毛高度、隐窝深度进行测量，并计算绒毛高度/隐窝深度。400倍显微镜下，记录杯状细胞数量。1.4.3部分紧密连接蛋白相关基因表达水平测定剪取35日龄蛋雏鸡空肠取中段，液氮速冻，置于-80 ℃冰箱。内参、空肠封闭小带蛋白1（zo-1）和紧密连接蛋白中闭锁蛋白（occludin）基因的引物由上海生物工程有限公司合成。引物序列见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.19.014.T002表2引物序列基因引物序列（5′→3′）产物大小/bp熔解温度/℃occludinF：AATACCAGGATGTGGCAGAGG20255R：CATGCGCTTGATGTGGAAGAzo-1F：CAACGTAGTTCTGGCATTATTCG16960F：R：GGAGGATGCTGTTGTCTCGGgapdhF：ACATCATCCCAGCGTCCA18960R：CATCAGCAGCAGCCTTCAC使用组织研磨机（宁波新艺）对样品磨碎，使用Magen R4121-02B试剂盒提取样品总mRNA。使用TaKaRa RR047A试剂盒将mRNA逆转录为cDNA，使用DBI Bioscience DBI-2043荧光定量试剂盒，按照其说明步骤，以1 µL的 cDNA为模板、反应体系为20 µL，每个样品4个平行。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）反应条件为：94 ℃ 10 min；94 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s 循环30次；95 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s。gapdh的Ct值作为内参，采用2-ΔΔCt进行计算各目的基因的相对表达量。1.5数据统计与分析采用SPSS 26.0软件对数据进行单因素方差分析（One-way ANOVA），采用Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1BSFLM对1~35日龄蛋雏鸡生长性能的影响（见表3）由表3可知，Ⅱ组和Ⅲ组蛋雏鸡的末重和平均日增重均显著高于Ⅰ组和Ⅳ组（P0.05）。Ⅱ组蛋雏鸡的料重比显著低于Ⅰ组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.19.014.T003表3BSFLM对1~35日龄蛋雏鸡生长性能的影响组别初重/g末重/gADG/(g/d)ADFI/(g/d)料重比胫骨长度/mm成活率/%Ⅰ组40.37±0.08326.04±1.90b8.16±0.05b20.07±0.542.46±0.03a44.74±0.4693.70±1.26Ⅱ组40.32±0.07342.50±2.04a8.63±0.06a20.19±0.422.34±0.01b44.82±0.5594.53±1.48Ⅲ组40.28±0.11337.33±2.10a8.49±0.06a20.21±0.622.38±0.01ab44.91±0.7394.67±2.12Ⅳ组40.37±0.08327.60±1.83b8.21±0.05b20.20±0.462.46±0.02a44.83±0.8394.86±1.55注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著（P0.05），字母相同或无字母表示差异不显著（P0.05）。2.2BSFLM对龄蛋雏鸡肠道形态结构的影响（见表4）由表4可知，Ⅱ组蛋雏鸡空肠绒毛高度和隐窝深度比值显著高于Ⅳ组（P0.05），Ⅱ组蛋雏鸡回肠绒毛高度显著高于Ⅰ组和Ⅳ组（P0.05），Ⅱ组和Ⅲ组蛋雏鸡回肠绒毛高度和隐窝深度比值显著高于Ⅰ组和Ⅳ组（P0.05），其他各组间差异均不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.19.014.T004表4BSFLM对龄蛋雏鸡肠道形态结构的影响项目Ⅰ组Ⅱ组Ⅲ组Ⅳ组空肠绒毛高度/μm769.27±61.90812.13±61.74796.16±51.08778.88±69.62隐窝深度/μm128.44±18.94120.44±17.84122.95±23.69130.48±15.09绒毛高度/隐窝深度6.28±0.72ab6.74±0.60a6.48±1.35ab5.97±0.70b杯状细胞数/(个/100细胞)23.33±2.4224.17±2.7922.33±2.4225.83±2.48回肠绒毛高度/μm478.99±60.46b552.74±57.37a527.98±54.77ab464.91±69.35b隐窝深度/μm108.17±18.78102.94±17.84100.72±19.21106.42±17.94绒毛高度/隐窝深度4.43±0.52b5.37±0.29a5.24±1.15a4.37±0.64b杯状细胞数/(个/100细胞)18.83±2.6419.50±2.4318.50±2.2619.17±2.14注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著（P0.05），字母相同或无字母表示差异不显著（P0.05）。2.3BSFLM对蛋雏鸡蛋白相关基因表达水平的影响（见图1）由图1可知，Ⅱ组和Ⅲ组蛋鸡空肠occludin表达水平显著高于Ⅰ组和Ⅳ组（P0.05）。Ⅱ组蛋鸡空肠zo-1表达水平显著高于Ⅰ组和Ⅳ组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.19.014.F001图1BSFLM对蛋雏鸡蛋白相关基因表达水平的影响注：图中小写字母不同表示差异显著（P0.05）。3讨论3.1BSFLM对1~35日龄蛋雏鸡生长性能的影响饲料中采用适宜比例的BSFLM替代豆粕、鱼粉等蛋白原料，可以提高家禽的生长性能。Dabbou等[3]研究表明，添加15%的BSFLM能够降低肉鸡平均日增重，提高料重比。本试验研究发现，添加3%和6%的BSFLM能够提高35日龄蛋雏鸡的末重和平均日增重，降低料重比。但是，9%添加量组蛋雏鸡的末重和平均日增重显著低于3%添加量组（P0.05），表明过量添加BSFLM会降低家禽生长性能，与Dabbou的结果有所不同[3]，原因可能与BSFLM的营养水平和几丁质有关。BSFLM脱脂程度越低，脂肪含量越高在肉鸡中的消化率越高[19]。畜禽机体不含有消化几丁质的酶，几丁质包裹蛋白质和脂质等营养物质，降低虫体消化率[20]。另外，不同饲喂底物的BSFLM营养价值存在较大的差异，如喂食鸡粪的BSFLM脂肪含量显著低于餐厨垃圾[12,17]。因此，添加不同营养水平的BSFLM能够对动物生长性能造成不同的影响[21]。3.2BSFLM对蛋雏鸡肠黏膜形态结构的影响肠道绒毛高度与小肠的吸收表面积相关，隐窝深度反映肠上皮细胞的分泌功能和成熟率[22]。黏膜上皮中杯状细胞作为肠黏膜屏障，分泌黏蛋白，捕获微生物，防止其他细菌入侵[17]。本研究表明，3%和6%添加组均能够明显增加回肠绒毛高度，改善空肠和回肠绒毛高度与隐窝深度比值，但9%添加组则明显降低了上述指标。因此，适宜添加水平的BSFLM可改善肠道黏膜结构。在肉鸡和罗曼蛋鸡中也得到类似的研究结果[3,23]。中链脂肪酸月桂酸具有改善肠黏膜结构的作用，能够通过淋巴系统进入血液，具有良好的抗菌、抗病毒特性[24]。研究发现，0.3 g/kg的月桂酸可以明显提高海兰褐蛋鸡空肠的绒毛高度以及绒毛高度/隐窝深度比[25]。通常BSFLM中月桂酸占总脂肪酸21.4%~49.3%[26]。本研究中，日粮中添加3%和6%BSFLM能够明显改善蛋鸡肠黏膜结构，可能与BSFLM中富含月桂酸有关。3.3BSFLM对蛋雏鸡蛋白相关基因表达水平的影响紧密连接蛋白是肠道黏膜上皮细胞屏障功能的重要组成部分，由occludin、密封蛋白（claudin）和zo-1等结构蛋白及各类连接蛋白分子共同组成。研究发现，机体受到细菌、病毒和内毒素感染时，上皮组织部分细胞因子或蛋白激酶C功能受到影响，进而影响occludin和zo-1的表达，使肠道上皮细胞的屏障功能降低[27]。适当的营养（益生素、小肽、多聚糖）调控措施可提高家禽和断奶仔猪的肠道屏障功能[17,28]。本试验中，添加3%和6%的BSFLM提高鸡空肠黏膜occludin和zo-1表达水平，其作用机理可能与几丁质、月桂酸和抗菌肽含量有关。4结论含3% BSFLM的试验日粮可以改善1~35日龄蛋雏鸡的生长性能和肠道黏膜组织结构，促进空肠黏膜紧密连接蛋白相关基因表达，改善肠道健康。