群体感应（QS）是1种细菌用来调节群体行为进行细胞间交流的系统[1]。QS系统是细菌根据种群密度调节其生理行为的机制，如细菌生物发光、毒力因子分泌、生物膜形成和其他生物行为[2]。许多畜禽致病性细菌利用QS机制来调控毒力因子的表达和生物膜的形成[3-5]。通过干扰病原菌的QS系统，可以显著减少毒力因子的产生和其生物膜的形成，紫色色杆菌（Chromobacterium violaceum）ATCC12472是1种能够自主分泌相关信号分子，从而调控QS性状紫色素产生的野生型菌种。研究人员根据其特性将其作为筛选抑制QS活性物质的模式菌株。红花籽粕是红花的种子红花籽经提取红花籽油后的副产品[6]。研究发现，红花籽粕中含有动物机体所需的19种氨基酸，是畜牧产业中1种潜在的亟待开发的饲料[7]。研究发现，红花籽粕具有降糖、抗菌、抗氧化和降脂等功能[8-11]。也有研究报道，使用20%红花粉替代豆粕，适宜虹鳟鱼的生长[12]。受孕母羊妊娠后期饲喂高亚油酸红花籽有利于提高羔羊的存活率[13]。关于红花籽粕细菌群体感应抑制方面的研究较少。因此，本试验利用QS模式细菌紫色色杆菌ATCC12472，研究红花籽粕的QS抑制活性，为后续进一步从红花籽粕中分离具有QS抑制效果的活性物质提供参考。1材料与方法1.1菌种与培养条件紫色色杆菌ATCC12472购自中国菌种保藏库，保藏号：ATCC12472。LB肉汤培养基：氯化钠10 g、胰蛋白胨10 g、酵母浸粉5 g、蒸馏水1 L，pH值7。30 ℃、160 r/min摇床中振荡培养。LB琼脂培养基：氯化钠10 g、胰蛋白胨10 g、酵母浸粉5 g、琼脂15 g、蒸馏水1 L，pH值7。1.2材料与试剂红花籽粕（新疆西部牧业有限公司）、呋喃酮C30((Z-)-4-Bromo-5-(bromomethylene)-2(5H)-furanone,C5H2Br2O2)（Sigma公司）、0.22 μm无菌过滤器（常德比克曼生物科技有限公司）、甲醇（天津北联精细化学品开发有限公司）、二甲基亚砜（DMSO）（北京博奥拓达科技有限公司）。1.3仪器设备酶标仪PowerWave XS2（美国博腾仪器有限公司）、LGJ-18S冷冻干燥机（北京松源华兴科技发展有限公司）、小型旋转蒸发仪（金坛市江南仪器厂）、小型高速离心机（赛莫飞世尔公司）、隔水式恒温培养箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）、微容量卧式摇床BSD-TX318（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）。1.4试验方法1.4.1红花籽粕的预处理参考文献[14-15]制备红花籽粕的提取物，红花籽粕除去杂质，45 ℃低温烘干，粉碎，过40目筛。称取40 g红花籽粕粉末于500 mL容量锥形瓶，按1∶10（质量体积比）的比例加入75%甲醇400 mL，30 ℃、160 r/min振荡8 h，真空抽滤除去红花籽粕残渣，收集残渣再将其按相同的方法提取2次，提取完成后收集3次提取的滤液，利用旋转蒸发器蒸发除去甲醇，收集水相使用真空冷冻干燥机干燥，收集干燥后的膏状物质，使用甲醇重悬为1.2 g/mL的重悬液，-20 ℃保藏备用。试验时将前期用甲醇重悬的粗提物使用甲醇倍比稀释为不同浓度的重悬液，使用前过0.22 μm的无菌过滤器。1.4.2红花籽粕提取物对紫色色杆菌ATCC12472的最小抑菌浓度（MIC）将紫色色杆菌ATCC12472进行2次过夜活化，30 ℃、160 r/min摇床中振荡培养直至其菌体密度OD600 nm约为0.3。取培养好的菌液4 mL，置于提前标记好的灭菌试管中，加入80 μL终浓度分别为25、50、100、200 g/L的红花籽粕提取物。对照组加入无菌等量的LB肉汤培养基。培养24 h，观察试管内菌的生长情况，通过菌液的浑浊度来确定红花籽粕提取物对紫色色杆菌ATCC12472的MIC。1.4.3红花籽粕提取物对紫色色杆菌ATCC12472生长的抑制作用将紫色色杆菌ATCC12472进行2次过夜活化，30 ℃、160 r/min摇床中振荡培养直至其菌体密度OD600 nm约为0.3。取培养好的菌液20 mL分装于50 mL锥形瓶中，加入400 μL终浓度分别为25、50、100、200 g/L的红花籽粕提取物，对照组加入无菌等量的LB肉汤培养基。30 ℃、160 r/min振荡培养，分别于0、2、4、6、8、10、12、14、16 h时测定OD600 nm值。每个试验浓度做3个平行，取其结果的平均值，将培养时间作为横坐标、OD600 nm作为纵坐标，绘制紫色色杆菌ATCC12472的生长曲线。1.4.4红花籽粕提取物对紫色色杆菌ATCC12472紫色素产生的定性抑制作用参考文献[16]采用指示菌平板法定性检测红花籽粕提取物的QS抑制活性，紫色色杆菌ATCC12472活化后培养至OD600 nm约为0.3，按5%的接种量（体积分数）接种至新鲜的冷却至45~50 ℃的LB琼脂培养基中，摇匀，制备平板，平板中的培养基凝固用打孔器进行打孔，孔直径为6 mm，将终浓度分别为25、50、100、200 g/L红花籽粕提取物每孔加20 μL；做等体积甲醇的阴性对照和等体积甲醇溶解的浓度为0.5 g/L呋喃酮C30的阳性对照，每个浓度3个重复，30 ℃隔水式恒温培养箱中将平板正置培养24 h，记录不同浓度的红花籽粕提取物对指示菌平板紫色素抑菌圈的半径，观察抑制效果。抑菌圈显示呈无色模糊圈时，则为抗群体感应活性，若为透明圈，则为抗菌作用。抑制圈的抑制半径=(抑制直径-加样孔直径)/2(1)1.4.5红花籽粕提取物对紫色色杆菌ATCC12472紫色素产生的定量抑制作用红花籽粕提取物对紫色色杆菌ATCC12472试管及色素测定试验参考文献[17-19]，挑取紫色色杆菌ATCC12472单个菌落于LB液体培养基中，30 ˚C、160 r/min过夜培养，使用新鲜LB肉汤培养基1∶100将其稀释，吸取3 mL菌液于事先灭菌制备好的试管中，分别取60 μL终浓度为25、50、100、200 g/L的红花籽粕提取物溶液加入上述试管，每个试验做3个平行对照，并做阴性对照、呋喃酮C30阳性对照和甲醇的试验对照。试管置于摇床中，30 ℃、160 r/min振荡培养24 h，取1 mL菌液，14 000 r/min离心15 min，弃上清，加入1 mL DMSO，充分振荡使紫色菌素完全溶解，14 000 r/min离心15 min，测定上清液在585 nm处吸光值。剩余菌体以等体积LB液体培养基重悬，测定600 nm处吸光值。根据数值计算不同红花籽粕提取物对紫色色杆菌ATCC12472紫色素产生的抑制率，确定样品是否具有抗QS活性及其抑制强度。紫色素抑制率=(对照组OD值-试验组OD值)/对照组OD值×100%(2)2结果与分析2.1红花籽粕提取物对紫色色杆菌ATCC12472的MIC（见表1）由表1可知，红花籽粕提取物对紫色色杆菌ATCC12472的MIC为300 g/L。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.19.018.T001表1红花籽粕提取物对紫色色杆菌ATCC12472的MIC质量浓度/(g/L)添加量/μL紫色色杆菌ATCC124722580+5080+10080+20080+30080-注：“+”表示浑浊，紫色色杆菌ATCC12472生长；“-”表示澄清，紫色色杆菌ATCC12472生长受到抑制。2.2红花籽粕提取物对紫色色杆菌ATCC12472生长抑制曲线（见图1）由图1可知，25、50、100、200 g/L红花籽粕提取物对紫色色杆菌ATCC12472的生长均无抑制作用。因此，红花籽粕提取物的试验浓度确定为≤200 g/L。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.19.018.F001图1红花籽粕提取物对紫色色杆菌ATCC12472生长抑制曲线2.3红花籽粕提取物对紫色色杆菌ATCC12472紫色素产生的定性抑制作用（见表2、图2）由表2、图2可知，不同浓度的红花籽粕提取物对紫色色杆菌ATCC1247紫色素产生均有抑制作用，200 g/L处理组抑制半径接近于阳性对照组。可见，在指示菌平板法检测中，红花籽粕提取物具有QS抑制活性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.19.018.T002表2红花籽粕提取物对紫色杆菌ATCC12472群体感应抑制活性项目质量浓度/(g/L)添加量/μL抑制半径/mm红花籽粕提取物25200.75±0.1850201.32±0.16100201.90±0.21200202.45±0.10呋喃酮C300.5202.76±0.27甲醇—20-注：“—”表示100%甲醇；“-”表示未出现抑菌圈。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.19.018.F002图2红花籽粕提取物对紫色色杆菌ATCC12472紫色素产生的抑制作用（定性）注：A为甲醇；B为0.5 g/L呋喃酮C30；C为25 g/L红花籽粕提取物；D为50 g/L红花籽粕提取物；E为100 g/L红花籽粕提取物；F为200 g/L红花籽粕提取物。2.4红花籽粕提取物对紫色色杆菌ATCC12472紫色素产生的定量抑制作用（见图3、图4）由图3可知，与空白对照组和甲醇试验组相比，25 g/L试验组紫色素含量无明显区别；50、100 g/L试验组紫色素含量有较明显的区分；200 g/L试验组紫色素含量明显减少，表现为浓度依赖性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.19.018.F003图3红花籽粕提取物对紫色色杆菌ATCC12472紫色素产生的抑制作用（定量）注：A为呋喃酮C30；B为甲醇处理组；C为空白对照组；D为25 g/L红花籽粕提取物；E为50 g/L红花籽粕提取物；F为100 g/L红花籽粕提取物；G为200 g/L红花籽粕提取物。由图4可知，在不抑制紫色色杆菌ATCC12472生长的前提下，25 g/L试验组对紫色色杆菌ATCC12472紫色素抑制率为7.5%，50 g/L试验组抑制率为26.4%，100 g/L试验组抑制率为32.5%，200 g/L试验组抑制率为62.7%，阳性对照组抑制率为77.5%。200 g/L红花籽粕提取物对紫色色杆菌ATCC12472紫色素产生的抑制效果最好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.19.018.F004图4红花籽粕提取物对紫色色杆菌ATCC12472紫色素产生的抑制作用（定量）3讨论研究表明，以紫色色杆菌ATCC12472为评价指标评价半枝莲根提取物对QS性状紫色素的抑制效应，发现其能够抑制QS的发生且呈剂量依赖性[20]。Moradi等[21]以紫色色杆菌CV026的QS性状紫色素为评价指标对用正己烷、甲醇和96%乙醇混合溶剂制备丁香、大青叶和赤桉的提取物进行验证，结果表明，在亚抑菌浓度下具有抑制QS的效应。化合物乙基麦芽酚在其亚抑菌浓度下可以降低紫色色杆菌CV026产紫色素的能力，且对杀鲑气单胞菌生物被膜形成、胞外蛋白酶活性和细菌群集和泳动具有一定的抑制作用[22]。Tang等[23]利用QS模式菌株紫色色杆菌CV12472研究评价海藻中羊栖菜根皮苷的抗QS活性，结果表明，紫色色杆菌对模式菌的紫色素产生有抑制作用，对铜绿假单胞菌胞外蛋白酶、溶血素和绿脓菌素的产生及其生物膜的形成也有抑制作用。一些药用植物提取物对紫色色杆菌CV12472和金黄色葡萄球菌均表现出抗QS活性[24]。本试验中，采用甲醇法制备红花籽粕提取物，使用前过0.22 μm的无菌滤膜，去除了部分抑制紫色色杆菌ATCC12472生长的物质；浓度为200 g/L的红花籽粕提取物对紫色色杆菌ATCC12472紫色素的抑制率达62.7%。研究表明，这种抑制作用不是抑制指示菌生长所致，而是红花籽粕提取物中抑制指示菌QS的活性物质引起的。可见植物来源的抑制QS活性的物质十分广泛，是筛选QS抑制剂的一大方向。4结论200 g/L的红花籽粕提取物对紫色素的抑制率达到62.7%，提示红花籽粕中所含的某些活性物质具有QS抑制作用。