肾脏是维持机体内环境稳定，保证新陈代谢正常运行的重要器官。研究发现，许多肾脏疾病均由氧化应激引起[1]。正常生理条件下，生物体内活性氧（ROS）的产生与抗氧化防御机制之间是平衡的。但是，如果细胞中形成了不能被外源物质充分去除的过剩ROS，可能会发生氧化应激反应[2]。因此，氧化应激被定义为由于自由基过度形成和抗氧化防御系统活性的降低，导致促氧化剂和抗氧化剂系统失衡[3]。抗氧化剂结合氧化底物，在低浓度下即可以迅速激发抗氧化系统，有效清除有害自由基[4]。多糖是一类在生物体内具有清除自由基、防止氧化损伤作用的大分子物质[5]。小麦麸皮多糖具有抗氧化、免疫、抑菌、抗肿瘤、抗病毒等生物活性，发酵可以提高小麦麸本身的营养价值[6]。本课题组前期通过微生物混合发酵获取了具有抗氧化活性的发酵麸皮多糖（FWBP），研究发现，FWBP可以有效激发大鼠空肠组织中抗氧化防卫系统，提高抗氧化酶活力，降低DNA氧化损伤产物8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）的含量，起到有效保护肠道健康的作用[7]。因此，本试验以断奶Wistar大鼠为动物模型，研究FWBP对大鼠肾脏组织抗氧化功能和相关抗氧化酶mRNA表达的影响，并通过核因子E2相关因子2（Nrf2）-抗氧化反应元件（ARE）途径初步探讨其作用机制，以期为FWBP作为新型植物多糖抗氧化剂应用于畜牧养殖中提供参考。1材料与方法1.1发酵麸皮多糖的制备FWBP由课题组自制研发，制备方法参照文献[8]。FWBP由葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖及木糖组成（物质的量之比46∶46∶5∶4∶9∶67）。1.2试验设计选取48只健康雄性Wistar断奶大鼠，按体重相近原则，随机分为6组，分别为空白对照组（生理盐水）、发酵麸皮多糖组（10、20、40和80 mg/kg BW）以及维生素C对照组（100 mg/kg BW），每组8个重复，每个重复1只。采用灌胃给予的方式，每日定时灌胃。试验期21 d。试验在内蒙古农业大学动物科学学院进行，常规饲养管理，自由采食和饮水。1.3样品采集试验最后1 d，每个重复取1只大鼠，使用乙醚将大鼠麻醉迷晕，对大鼠进行解剖，采集肾脏组织，使用冰冷的生理盐水冲洗，装在采样袋中，置于液氮中速冻，将液氮冻好的样品放置在-80 ℃低温冰箱保存，待测。1.4测定指标及方法1.4.1抗氧化指标取适量肾脏组织，添加磷酸盐缓冲液（0.01 mol/L，pH值7.4）制备质量分数10%的组织匀浆，3 000 r/min离心10 min，取上清液用于抗氧化相关指标测定。总抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性以及谷胱甘肽（GSH）、8-OHdG含量均采用ELISA试剂盒测定。试剂盒均购自武汉基因美生物科技有限公司，所有操作均严格按说明书进行。1.4.2mRNA表达水平采用LightCycler LC 480荧光定量PCR仪（Roche公司）检测谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基（GCLC）、谷氨酸-半胱氨酸连接酶调节亚基（GCLM）、醌氧化还原酶1（NQO1）、血红素氧合酶（HO-1）及核因子E2相关因子2（Nrf2）和β-肌动蛋白（β-actin）的mRNA相对表达量并采用2-△△ct法进行计算，所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，抗氧化基因的引物序列见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.19.015.T001表1抗氧化基因的引物序列基因名称上下游引物序列（5'→3'）片段大小/bp基因序列号β-actinFCCTAAGGCCAACCGTGAAAA103NM_031144.2RCAGAGGCATACAGGGACAACACNrf2FTTGGCAGAGACATTCCCATTTGTA116NM_031789.2RGAGCTATCGAGTGACTGAGCCTGAGCLCFGTGGACACCCGATGCAGTATTC87NM_012815.2RCATCCACCTGGCAACAGTCATTAGGCLMFAGACCGGGAACCTGCTCAAC113NM_017305.2RGATTTGGGAGCTCCATTCATTCAHO-1FAGGTGCACATCCGTGCAGAG120NM_012580.2RCTTCCAGGGCCGTATAGATATGGTANQO1FTGGAAGCTGCAGACCTGGTG133NM_017000.3RCCCTTGTCATACATGGTGGCATAC1.5数据统计与分析以β-actin为内参，采用2-△△ct法对抗氧化酶和Nrf2-ARE通路相关基因的相对表达量计算。使用Excel对试验数据进行初步整理，采用SAS 9.2中GLM模型分析，若处理组间差异显著，采用Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准误”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1FWBP对大鼠肾脏抗氧化指标的影响（见表2）由表2可知，与空白对照组相比，灌胃10、20、40 mg/kg BW FWBP组大鼠肾脏的GSH含量显著提高（P0.05），灌胃40 mg/kg BW FWBP大鼠肾脏中8-OHdG含量显著降低（P0.05），灌胃40 mg/kg BW FWBP组大鼠肾脏中SOD活性比对照组提高15.94%，但差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.19.015.T002表2FWBP对大鼠肾脏抗氧化指标的影响项目FWBP灌胃剂量/(mg/kg BW)VC010204080T-AOC/(U/mL)0.62±0.050.73±0.030.66±0.060.65±0.060.63±0.080.61±0.05CAT/(μg/L)0.70±0.050.67±0.050.70±0.060.68±0.070.70±0.060.65±0.07SOD/(ng/L)173.00±1.34179.45±3.76171.96±2.70200.57±3.24172.29±2.68185.26±3.74GSH-Px/(μg/L)0.42±0.050.44±0.050.44±0.060.45±0.080.38±0.060.39±0.03GSH/(mg/L)0.49±0.07b0.75±0.11a0.75±0.30a0.71±0.18a0.59±0.10ab0.58±0.08 ab8-OHdG/(ng/L)193.49±0.66a195.14±1.43a192.52±1.71a159.22±1.93b176.31±2.54ab179.75±1.88ab注：同行数据肩标小写字母不同表示差异显著（P0.05），字母相同或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.2FWBP对大鼠肾脏抗氧化相关基因表达的影响（见表3）由表3可知，与空白对照组相比，灌胃80 mg/kg BW FWBP组大鼠肾脏中Nrf2及GCLM mRNA的表达量显著提高（P0.05），灌胃10、20 mg/kg BW FWBP组大鼠肾脏中的GCLC的mRNA表达量显著提高（P0.05），灌胃20 mg/kg BW FWBP可以显著提高大鼠肾脏中NQO1的mRNA表达量（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.19.015.T003表 3FWBP对大鼠肾脏抗氧化相关基因表达的影响项目FWBP灌胃剂量(mg/kg BW)VC010204080Nrf21.00b1.08±0.28b1.33±0.43ab1.20±0.25ab1.47±0.19a1.26±0.08abGCLC1.00b1.35±0.25a1.33±0.31a1.23±0.33ab1.21±0.15ab1.29±0.19abGCLM1.00c1.14±0.16abc1.04±0.20bc1.18±0.21abc1.29±0.05a1.20±0.17abHO-11.000.76±0.250.67±0.200.99±0.190.91±0.550.83±0.14NQO11.00b1.09±0.33b1.61±0.83a0.90±0.22b1.01±0.41b1.11±0.36b3讨论过多的ROS会攻击和破坏DNA、蛋白质、碳水化合物、核酸和膜脂等细胞成分，导致细胞死亡，组织损伤，同时引发一系列健康问题，如心血管疾病、类风湿性关节炎、糖尿病等[9-10]。研究发现，抗氧化酶的表达可以有效缓解由ROS引起的氧化应激[11-12]。GSH可利用巯基有效清除机体所产生的多余的ROS，同时作为GSH-Px的底物被催化为氧化型谷胱甘肽（GSSG），清除体内的过氧化氢（H2O2）与脂质过氧化物[13]。8-OHdG是核酸氧化的标志物，由DNA氧化损伤产生，常被用来评判DNA氧化损伤[14]。本试验表明，FWBP可以通过提高抗氧化酶活力，减少肾脏组织中自由基的积累，进而减轻肾脏组织的氧化损伤。Wang等[15]以AAPH为自由基诱导剂，测定大鼠摄入0.5 mg阿魏酰寡糖后血浆的抗自由基能力，结果表明，与对照组相比，饲喂阿魏酰寡糖的大鼠血浆中抗氧化酶活性升高，GSSG和MDA含量降低，溶血反应的抵抗力高于对照组。Yao等[16]报道，阿魏酰低聚糖可以明显降低H2O2诱导的嗜铬细胞瘤株（PC12）中MDA含量和乳酸脱氢酶（LDH）活性，提高SOD活性，并通过减少LDH释放来保护细胞膜的损伤。为了进一步探讨FWBP提高大鼠肾脏抗氧化能力的可能分子机制，本试验继续测定抗氧化相关基因的相对表达量。Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1（Keap1）-Nrf2/ARE是细胞抵御氧化应激的关键通路。研究发现，植物多糖可通过不同的方法途径激活此通路：①通过与GSH结合，降低细胞内GSH含量，使氧化还原状态呈现短暂的中断，进而激活丝裂原激活蛋白激酶（MAPK），触发Nrf2磷酸化；②直接与Kelch 样环氧氯丙烷相关蛋白1（Keap1）中的半胱氨酸残基相互作用，从而诱导Nrf2解离；③其自身产生的ROS还可以氧化Keap1的半胱氨酸硫醇，使Nrf2与Keap1的亲和力降低，从而促进Nrf2的释放以进行核转位。在细胞核中，Nrf2继续与Small Maf转录因子（sMafs）结合，形成异源二聚体，与ARE或电泳反应元件（EPRE）结合，进而刺激抗氧化酶或Ⅱ相解毒酶表达[17-19]。GCLC和GCLM是GSH的合成关键酶，二者合成增加可促进GSH的合成，减少ROS的产生[20]。NQO1是1种重要的Ⅱ相抗氧化酶[21]。GCLC、GCLM的上调同时解释了肾脏组织中GSH含量增多的原因。Zhang等[22]研究发现，麦麸阿魏酰低聚糖可以明显提高大鼠心、肝、肾组织中SOD、CAT、GSH-Px活性及GSH的含量，同时上调各脏器SOD、CAT和HO-1 mRNA的表达水平以及Nrf2蛋白表达水平，与本试验结果相似。因此可以推测，FWBP可以通过激活Nrf2，增加GCLC、GCLM及NQO1的mRNA表达量，进而提高大鼠肾脏的抗氧化能力。4结论FWBP的抗氧化作用可能通过激活Nrf2，促进GCLC、GCLM和NQO1的转录和表达，诱导GSH的分泌，减少DNA氧化损伤，进而提高大鼠肾脏的抗氧化能力，有效保护肾脏的健康。因此，FWBP具有较好的抗氧化能力，可以作为1种新型植物多糖抗氧化剂应用于饲料添加剂领域。