肠道是机体表面积最大的免疫器官，肠道特异性免疫及黏膜屏障组成肠道免疫系统，是机体第一道免疫防线的重要组成部分[1]。肠道可以有效阻挡细菌向肠外移位，引发高效的细胞免疫和体液免疫。在机体中，超过90%的感染发生在黏膜或通过黏膜入侵。因此，肠黏膜是机体抵御感染的重要屏障[2]。营养调控是维持畜禽肠道免疫处于最佳水平的方式，是保证肠道健康、减少疾病的重要调控措施。如酶制剂、酸化剂、中草药等添加剂进入消化道后直接与肠道接触，产生相互作用，可以改善肠道内环境，增强机体免疫功能[3]。研究表明，植物提取物可以改善动物的生长和生产性能，维持肠道特异性免疫，对肠道具有营养调控和保健的双重功效[4]。因此，可以改善动物肠道免疫和机体健康的安全高效的绿色饲料添加剂成为研究者关注的热点。黑沙蒿（Artemisia）是1种常用中、蒙医药材，含有丰富的化学成分。黑沙蒿提取物可以调节肉鸡血清中的免疫指标水平[5]。但是，关于黑沙蒿对肠道免疫影响的研究报道较少。因此，本试验在肉仔鸡日粮中添加黑沙蒿黄酮（Artemisia ordosica flavonoids，AOF），以肠道黏膜中免疫球蛋白和细胞因子的含量以及肠道组织中IL-1β和IL-6的mRNA表达量为评价指标，探究黑沙蒿黄酮对肉仔鸡肠道免疫功能的影响，为黑沙蒿黄酮在肉鸡中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料黑沙蒿采自内蒙古鄂尔多斯，全株收割，室温阴干，切成小段，粉碎，参照陈苏丹等[6]的提取方法，按照料液比1∶30（g/mL）加入60%乙醇溶液，50 ℃、200 W超声1 h。提取液放入旋转蒸发仪中浓缩，浓缩液使用冷冻干燥机冻干成粉，所得干粉即为本试验所需AOF。经NaNO2-Al(NO3)3-NaOH分光光度法测定，AOF中总黄酮含量约55.61%。1.2试验设计试验采用单因子随机设计，选取240只肉仔鸡按照体重相近原则随机分为5组，每组6个重复，每个重复8只肉仔鸡（公、母各半）。试验期42 d。对照组肉仔鸡饲喂基础日粮，试验组分别在基础日粮中添加250、500、750、1 000 mg/kg的AOF。参照NY/T 33—2004中家禽营养需要量设计玉米-豆粕型基础日粮。基础日粮组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.19.010.T001表1基础日粮组成及营养水平（风干基础）项目1~21日龄22~42日龄原料组成/%玉米52.5058.80豆粕40.0033.80豆油3.003.00石粉1.081.22磷酸氢钙1.901.80氯化钠0.370.37蛋氨酸0.190.07赖氨酸0.050.03胆碱0.110.11微量元素预混料0.500.50维生素预混料0.300.30合计100.00100.00营养水平代谢能/(MJ/kg)12.4212.62粗蛋白质/%21.7719.65钙/%1.001.02有效磷/%0.440.42赖氨酸/%1.341.15蛋氨酸/%0.550.40胱氨酸/%0.400.36注：1.微量元素预混料为每千克日粮提供：铁100 mg、铜10 mg、锌108 mg、锰120 mg、碘1.5 mg、硒0.35 mg。2.维生素预混料为每千克日粮提供：VA 9 000 IU、VD3 3 000 IU、VE 26 IU、VK3 1.20 mg、VB1 3.00 mg、VB2 8.00 mg、VB6 4.40 mg、VB12 0.012 mg、烟酸45 mg、泛酸钙15 mg、叶酸0.75 mg、生物素0.20 mg、胆碱1 100 mg。3.营养水平中代谢能为计算值，其余均为实测值。1.3饲养管理试验前对鸡舍环境、鸡笼和器具等彻底消毒。采用单层笼养方式，鸡只自由采食和饮水，自然通风，保持舍内空气清洁。采用红外线加热装置的自动控温系统，试验前3 d保持舍温33 ℃，之后每周降低3 ℃，降至21 ℃，保持恒定。试验第1~3 d，每天保持23 h光照；第4~21 d，每天保持10 h光照；第22~42 d，每天保持23 h光照。试验期间每天人工清粪1次，保证料槽饲料和饮水充足。按照王俊丽[7]的方法进行常规免疫。每日观察并记录鸡的精神状态，及时剔除病鸡。1.4样品采集分别于试验第21 d与42 d屠宰肉仔鸡，分离剪取空肠、回肠和十二指肠各两份（3 cm）。一份置于锡箔纸中，-20 ℃保存，用于免疫指标的测定；另一份置于冻存管中，-80℃保存，用于基因表达测定。1.5测定指标及方法1.5.1肠道免疫指标取0.5 g空肠、回肠和十二指肠组织黏膜样，分别放入10 mL离心管，按l∶9加入4.5 mL预冷生理盐水，充分匀浆，4 ℃、3 000 r/min离心15 min，取上清液。使用ELISA试剂盒测定各肠段黏膜中分泌型免疫球蛋白A（sIgA）、免疫球蛋白G（IgG）和免疫球蛋白M（IgM）以及白细胞介素1β（IL-1β）、白细胞介素2（IL-2）、白细胞介素4（IL-4）、白细胞介素6（IL-6）的含量。试剂盒均购自泉州睿信生物科技有限公司。1.5.2肠道IL-1β和IL-6 mRNA表达量使用Trizol试剂盒（TaKaRa）提取各组织总RNA，利用分光光度计（Pultton P200CM）对总RNA的纯度和浓度进行检测。使用Hifair® Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（gDNA digester plus）试剂盒将总RNA反转录为cDNA；步骤为37 ℃，15 min；85 ℃，5 s，-80 ℃保存，用于实时荧光定量PCR。使用Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix（No Rox）试剂盒实时荧光定量PCR；步骤为95 ℃，30 s，1次循环反应。95 ℃，5 s；60 ℃，33 s；35次循环反应。95 ℃，15 s；60 ℃，60 s；95 ℃，1s，1次循环反应。所有样品运行2个重复，进行熔解曲线分析。本试验以β-actin为内参基因，采用2-ΔΔCt法[8]进行基因相对定量分析。β-Actin、IL-1β和IL-6基因引物序列见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.19.010.T002表2β-Actin、IL-1β和IL-6基因引物序列基因碱基序列（5'→3'）Gene Bank登录号长度/bpβ-ActinF：GCCAACAGAGAGAAGATGACACNM_205518118R：GTAACACCATCACCAGAGTCCAIL-1βF：CAGCCTCAGCGAAGAGACCTTNM_20452484R：ACTGTGGTGTGCTCAGAATCCIL-6F：AAATCCCTCCTCGCCAATCTHM179640106R：CCCTCACGGTCTTCTCCATAAA1.6数据统计与分析试验数据采用Excel 2010软件进行整理，采用SAS 9.2软件GLM模型进行单因素方差分析（One-way ANOVA），采用Duncan's法进行多重比较，采用回归分析判断AOF添加的剂量效应，结果以平均值和总标准误表示，P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1黑沙蒿黄酮对肉仔鸡肠道黏膜中免疫球蛋白含量的影响（见表3）由表3可知，试验第21 d，随着AOF添加量的增加，肉仔鸡空肠黏膜中IgG和IgM的含量均呈极显著的二次曲线升高效应（P0.01）；肉仔鸡回肠黏膜中sIgA的含量呈显著的一次线性或二次曲线升高效应（P0.05），IgM的含量呈极显著的二次曲线升高效应（P0.01）。方差分析结果表明，与对照组相比，日粮中添加不同剂量的AOF均可以显著提高回肠黏膜中sIgA的含量（P0.05），日粮中添加500、750 mg/kg AOF极显著提高空肠黏膜中IgG和IgM的含量以及回肠黏膜中IgM的含量（P0.01）。试验第42 d，随着AOF添加量的增加，肉仔鸡十二指肠黏膜中sIgA的含量呈显著的一次线性升高效应（P0.05），肉仔鸡空肠黏膜中sIgA、IgG以及IgM的含量均呈极显著的一次线性或二次曲线升高效应（P0.01）；肉仔鸡回肠黏膜中sIgA、IgG的含量均呈显著的一次线性或二次曲线升高效应（P0.05）。方差分析结果表明，与对照组相比，日粮中添加750、1 000 mg/kg AOF极显著提高空肠黏膜中sIgA、IgG和IgM的含量（P0.01），添加750 mg/kg AOF显著提高回肠黏膜中sIgA和IgG的含量（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.19.010.T003表3黑沙蒿黄酮对肉仔鸡肠道黏膜中免疫球蛋白含量的影响项目AOF添加量/(mg/kg)SEMP值02505007501 000线性二次21 dsIgA/(μg/g prot)十二指肠133.44127.39136.53151.87108.129.000.6440.269空肠176.99194.72208.36201.49180.839.750.6010.085回肠150.39b195.98a193.74a194.94a190.10a11.560.0360.011IgG/(mg/g prot)十二指肠114.42125.55126.86123.94102.237.550.3270.092空肠169.79BC207.77AB229.36A232.26A150.47C17.980.8260.001回肠139.54162.87160.87164.33149.609.190.5090.135IgM/(mg/g prot)十二指肠38.0340.1440.5941.3029.212.890.2390.066空肠55.31B69.62A71.89A72.80A67.78B3.470.4500.001回肠40.60B55.97A55.99A57.70A49.23AB3.530.1450.00142 dsIgA/(μg/g prot)十二指肠108.96107.27115.53123.35120.054.500.0170.057空肠139.34C181.59B153.32C214.04A212.20A14.470.0010.001回肠165.85b168.05b186.36ab202.58a178.83ab9.090.0410.039IgG/(mg/g prot)十二指肠97.1999.55100.01110.87102.933.880.1430.307空肠126.32B149.36B137.93B187.33A201.93A14.860.0010.001回肠146.50b152.20b168.11ab187.68a164.92ab9.120.0130.013IgM/(mg/g prot)十二指肠33.8734.3635.9938.3536.381.450.0760.157空肠42.10B47.67B45.60B61.39A60.63A4.160.0010.001回肠54.1254.2457.3759.5260.592.740.0590.175注：同行数据肩标小写字母不同表示差异显著（P0.05），大写字母不同表示差异极显著（P0.01），无字母或字母相同表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.2黑沙蒿黄酮对肉仔鸡肠道黏膜中细胞因子含量的影响（见表4）由表4可知，试验第21 d，随着AOF添加量的增加，肉仔鸡十二指肠黏膜中IL-6的含量呈极显著的一次线性或二次曲线下降效应（P0.01）；回肠黏膜中IL-1β的含量呈显著的一次线性降低效应（P0.05）；空肠黏膜中IL-2和IL-4的含量呈显著的一次线性（P0.05）或极显著的二次曲线升高效应（P0.01）；回肠黏膜中IL-2的含量呈极显著的二次曲线升高效应（P0.01），IL-4的含量呈显著的一次线性或二次曲线升高效应（P0.05）。方差分析结果表明，与对照组相比，日粮中添加500~1 000 mg/kg AOF极显著提高空肠黏膜中IL-4的含量（P0.01），显著提高空肠黏膜中IL-2的含量（P0.05）；日粮中添加500、750 mg/kg AOF极显著提高回肠黏膜中IL-2的含量（P0.01）。试验42 d，随着AOF添加量的增加，肉仔鸡十二指肠黏膜中IL-6的含量呈显著的一次线性或二次曲线下降效应（P0.05），IL-4的含量呈显著的一次线性或二次曲线升高效应（P0.05）；空肠黏膜中IL-2的含量呈极显著的一次线性或二次曲线升高效应（P0.01），IL-4的含量呈极显著的一次线性（P0.01）或显著的二次曲线升高效应（P0.05）；回肠黏膜中IL-2的含量呈显著的一次线性或二次曲线升高效应（P0.05），IL-4的含量呈显著的一次线性升高效应（P0.05）。方差分析结果表明，与对照组相比，日粮中添加不同剂量的AOF均极显著降低十二指肠黏膜中IL-6的含量（P0.01），日粮中添加750、1 000 mg/kg AOF，空肠黏膜中IL-2的含量极显著升高（P0.01），IL-4的含量显著升高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.19.010.T004表4黑沙蒿黄酮对肉仔鸡肠道黏膜中细胞因子含量的影响项目AOF添加量/(mg/kg)SEMP值02505007501 000线性二次21 dIL-1β十二指肠34.6033.2033.9232.1228.421.630.0630.127空肠47.9545.6848.0942.9844.002.690.1640.368回肠51.1249.5247.5542.9343.152.760.0240.082IL-6十二指肠1.961.961.921.791.480.100.0070.006空肠2.312.262.332.252.170.120.5660.807回肠2.983.002.922.762.670.150.0840.205IL-2十二指肠14.4215.0915.8415.5613.361.110.6640.441空肠13.26b16.73a17.62a17.04a17.30a1.010.0130.005回肠16.46C21.79A20.74AB21.13A17.75BC1.130.6720.003IL-4十二指肠8.729.109.139.538.120.560.6740.458空肠9.84C11.43BC13.99A14.14A12.23AB0.880.0100.001回肠9.5912.0412.2413.2812.480.840.0220.02042 dIL-1β十二指肠27.1426.9024.8423.7923.751.240.0500.152空肠49.1742.5740.5943.4146.482.400.8480.149回肠40.5237.6937.7137.8839.651.460.7560.413IL-6十二指肠2.05A1.65B1.67B1.57B1.69B0.090.0160.001空肠2.912.522.262.572.930.210.7550.075回肠2.782.682.572.552.500.120.0920.225IL-2十二指肠12.0912.3812.3513.1012.780.550.2560.515空肠17.90C22.37AB19.47BC25.22A24.73A1.730.0010.006回肠18.8119.1020.2821.8721.441.000.0110.043IL-4十二指肠5.665.916.356.506.440.230.0200.047空肠9.60b11.83ab10.59ab12.72a12.61a0.840.0060.023回肠9.079.489.5510.2210.680.530.0250.080ng/g prot2.3黑沙蒿黄酮对肉仔鸡肠道IL-1β和IL-6 mRNA表达量的影响（见表5）由表5可知，试验第21 d，随着AOF添加量的增加，肉仔鸡十二指肠IL-6 mRNA表达量呈显著的一次线性或二次曲线降低效应（P0.05）；回肠中IL-1β mRNA表达量呈显著的一次线性降低效应（P0.05），IL-6 mRNA表达量呈极显著的一次线性或二次曲线降低效应（P0.01）。方差分析结果表明，与对照组相比，日粮中添加500 mg/kg AOF回肠中IL-6 mRNA表达量极显著降低（P0.01）。试验第42 d，随着AOF添加量的增加，十二指肠中IL-6 mRNA表达量呈显著的一次线性或二次曲线降低效应（P0.05）。方差分析结果表明，与对照组相比，日粮中添加750 mg/kg AOF十二指肠中IL-1β mRNA表达量极显著降低（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.19.010.T005表5黑沙蒿黄酮对肉仔鸡肠道IL-1β和IL-6 mRNA表达量的影响项目AOF添加量/(mg/kg)SEMP值02505007501000线性二次21 dIL-1β十二指肠1.000.930.830.920.920.070.4740.375空肠1.001.070.981.001.200.090.2570.330回肠1.001.000.900.790.830.070.0210.070IL-6十二指肠1.000.950.830.830.820.060.0120.029空肠1.000.991.090.921.130.080.5550.752回肠1.00B0.94BC0.80C0.96BC1.40A0.080.0060.00142 dIL-1β十二指肠1.00A1.15A1.04A0.79B1.14A0.070.6890.644空肠1.001.341.191.171.240.080.1710.177回肠1.001.280.910.911.180.090.9710.579IL-6十二指肠1.001.000.820.780.880.060.0290.035空肠1.001.181.011.031.010.080.6810.715回肠1.001.121.070.960.930.060.2050.1523讨论肠道是营养物质消化吸收的主要场所，在免疫调控方面发挥重要作用[9]。肠道黏膜可以防止细菌或病毒等微生物入侵，影响肠道健康。肠道相关淋巴组织及其分泌的免疫球蛋白、细胞因子等免疫物质共同构成肠黏膜免疫屏障[10-11]。其中，sIgA是肠道黏膜固有层浆细胞产生的主要免疫效应因子，是肠道黏膜中含量最丰富的免疫球蛋白[12]。sIgA是参与组成肠道黏膜免疫的第一道防线，可以调控肠道菌群定植和生长，改变其自身对肠道菌群的免疫应答反应。因此，sIgA在肠道黏膜免疫和自身免疫性疾病中的作用受到关注[13]。促炎症细胞因子如IL-1β、IL-6是先天免疫应答后引起代谢级联改变的主要细胞信使，在多种炎症反应中发挥重要作用[14]。Yuan等[15]报道，饲喂杜仲黄酮能够降低仔猪促炎因子IL-1β、IL-6、干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的含量，改善消化道屏障功能的作用。研究发现，金银花醇提液对肠道结构没有破坏作用，可以显著提高肠黏膜中sIgA的含量（P0.05），并通过调节IFN-γ/IL-4来增强肠道黏膜免疫[16]。本试验研究表明，与对照组相比，日粮中添加AOF可以不同程度地提高肠道黏膜中sIgA、IgG和IgM的含量。由于AOF的添加，肉仔鸡肠道黏膜中抗炎因子IL-2和IL-4的含量显著升高（P0.05），十二指肠中促炎因子IL-6的含量显著降低（P0.05），IL-1β mRNA表达量显著下调（P0.05）；随着AOF添加量的增加，肠道黏膜中免疫球蛋白和细胞因子的含量呈显著的一次线性或二次曲线升高效应（P0.05）。研究发现，摄入富含类黄酮的植物也可以使外周血单核细胞的增殖反应明显增强，促进IL-2和IL-4等细胞因子的分泌[17]。岳远西等[18]研究发现，适宜剂量黑沙蒿提取物可以促进肉仔鸡肠道免疫功能，增加IgM和IgG的水平。上述研究结果均与本试验结果相似。因此，推断AOF以剂量依赖的方式调节肠道黏膜免疫，改善肠道健康水平。4结论日粮中添加AOF可以明显提高肉仔鸡肠道黏膜中sIgA、IgG和IgM的含量以及IL-2和IL-4的含量，降低IL-6的含量以及IL-1β mRNA表达量，从而调节肠道免疫，且添加量为750 mg/kg AOF效果较优。