红曲菌具有较强生产γ-氨基丁酸能力，红曲菌代谢产物中还含有洛伐他汀（monacolin K）、红曲多糖、红曲色素等其他功能性物质。因此，利用红曲菌生产γ-氨基丁酸具有一定优势，但部分红曲菌在发酵过程中会产生桔青霉素。因此，在使用红曲菌发酵生产γ-氨基丁酸时需要检测桔青霉素含量[1-2]。γ-氨基丁酸是功能性非蛋白质氨基酸，具有较高的利用价值，目前已广泛应用于食品、药品及化妆品行业[3-7]。γ-氨基丁酸作为饲料添加剂在饲料中的应用仍处于探索阶段。研究表明，γ-氨基丁酸作为饲料添加剂具有很好的应用前景[8-10]。γ-氨基丁酸能够有效增强畜禽免疫力、抗氧化能力，改善肉类、蛋类品质，提高家禽热应激能力，改善家禽生产性能。同时γ-氨基丁酸还能够提高水产动物的采食量及抗应激能力，从而提高养殖经济效益[3,11-16]。2009年，γ-氨基丁酸已被批准为新资源食品，目前，γ-氨基丁酸供应远远不能满足市场需求。固态发酵生产的γ-氨基丁酸可以直接应用于饲料行业，无须进行提取纯化，简化了生产流程，降低了生产成本。因此，红曲菌固态发酵产γ-氨基丁酸的研究具有较大的市场价值。本试验对红曲菌固态发酵生产γ-氨基丁酸的发酵工艺进行研究，旨在为γ-氨基丁酸的提取优化提供参考。1材料与方法1.1红曲菌株本实验室保存菌株：红色红曲菌9901、丛毛红曲菌9908、红色红曲菌9909、紫色红曲W1、紫色红曲菌ZH2、紫色红曲菌ZH6和紫色红曲菌SJS-6。1.2培养基的制备PDA琼脂斜面培养基：200 g土豆去皮，切块，800 mL水煮沸30 min，8层纱布过滤，使用双蒸水定容至1 000 mL，加入20 g葡萄糖、20 g琼脂，融化，倒入试管。115 ℃灭菌15 min，放置斜面。种子培养基：葡萄糖60 g/L、蛋白胨25 g/L、NaNO3 2 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、K2HPO4·3H2O 1 g/L、玉米浆粉6 g/L，121 ℃灭菌20 min。发酵培养基：50 g广西籼米、适量的双蒸水，灭菌冷却。1.3试验方法1.3.1菌种斜面4 ℃冰箱保藏的菌种放在30 ℃恒温箱中活化24 h，超净工作台中将菌种转接到新鲜的PDA斜面上，30 ℃恒温箱中培养8 d。1.3.2孢子悬浮液制备在超净工作台中使用无菌水将菌种孢子从斜面洗脱下来，制成孢子浓度为1×106个/mL的孢子悬液，用于接种。1.3.3液态种子培养孢子悬液按一定比例接种在装有100 mL种子培养基的500 mL三角瓶中，30 ℃、170 r/min旋转式摇床培养48 h。1.3.4固态发酵培养将长好的液态种子按一定比例（最佳为25%）接种在固态发酵瓶中。固态发酵瓶放于生化培养箱28 ℃培养7 d。1.4γ-氨基丁酸检测样品处理：将发酵结束的红曲米放于50 ℃鼓风干燥箱中，烘干至恒重，粉碎机粉碎，过100目筛。精确称取0.50 g样品于50 mL比色管中，50 mL双蒸水分3次超声萃取，上清液使用双蒸水定容至50 mL，取上清液，0.45 μm过滤器过滤，待测。检测方法（OPA柱前衍生法检测）：衍生试剂配制：0.25 g邻苯二醛，2.5 mL乙腈溶解，加325 μL β-巯基乙醇，0.4 mol/L pH值10的硼酸溶液定容至25 mL。取0.7 mL的待测液及0.7 mL的衍生试剂，混匀反应2 min，液相检测。检测条件：Waters 2487；色谱柱：20 RBA×SB-C18，5 μm×150 mm×4.6 mm。流动相A：8 g结晶乙酸钠，去离子水定容至1 L，加220 μL三乙胺，乙酸调节pH值至7.2，加5 mL四氢呋喃，混匀过滤；流动相B：2 g结晶乙酸钠，去离子水定容至200 mL，醋酸溶液调节pH值至约7.2，分别加400 mL的乙腈及甲醇，混匀过滤；柱温：28 ℃；流速：1 mL/min；进样量：20 μL；检测器：UV λ=338 nm。梯度洗脱程序见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.20.014.T001表1梯度洗脱程序时间/minA/%B/%流速/(mL/min)09281.020.060401.024.001001.524.501001.526.510001.028.09281.0γ-氨基丁酸含量(mg/g)=c×0.05/[0.5×(1-产物水分含量)](1)产品收率=产品干重/原料干重×100%(2)式中：c为萃取液中γ-氨基丁酸含量（mg/L）；0.05为萃取液体积（L）；0.5为样品质量（g）。1.5红曲菌固态发酵产γ-氨基丁酸工艺优化1.5.1红曲菌固态发酵产γ-氨基丁酸工艺单因素试验以直链淀粉含量相对较高、黏度相对较小、水分含量为8.8%的广西籼米作为固态发酵基质，以500 mL的三角瓶为发酵容器，每瓶装料量为50 g，加适量的双蒸水浸泡，灭菌。研究7株红曲菌固态发酵生产γ-氨基丁酸的能力，从中筛选出1株相对高产红曲菌株。使用该株菌株研究红曲菌固态发酵产γ-氨基丁酸的最适发酵时间、加水量、接种量及培养温度。1.5.2紫色红曲菌ZH2固态发酵产γ-氨基丁酸响应面优化综合单因素试验结果及实际情况，选取加水量（A）、接种量（B）和培养温度（C）为自变量，以γ-氨基丁酸的产量作为因变量，利用Design-Expert设计3因素3水平的BBD试验。响应面试验因素与水平设计见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.20.014.T002表2响应面试验因素与水平设计水平A加水量/mLB接种量/%C温度/℃-1252020030252513530302结果与分析2.1γ-氨基丁酸线性关系为验证所选检测方法的科学性，配制浓度为12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 mg/L的γ-氨基丁酸标准液。检测γ-氨基丁酸含量。以峰面积为纵坐标（y），γ-氨基丁酸浓度为横坐标（x），采用Excel软件绘制标准曲线，γ-氨基丁酸标准曲线见图1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.20.014.F001图1γ-氨基丁酸标准曲线由图1可知，γ-氨基丁酸标准曲线方程为y=19 408x，R2=0.999 9。γ-氨基丁酸含量为12.5~200 mg/L时，线性关系良好。因此，该方法适合作为γ-氨基丁酸的检测。2.27株红曲菌固态发酵γ-氨基丁酸筛不同红曲菌株除了菌落、菌丝形态存在一定差异外，发酵产γ-氨基丁酸也有较大差异[17-18]，可能与不同红曲菌的基因及代谢途径差异有着直接关系。选用实验室保存的7株红曲菌，7株红曲菌固态发酵产γ-氨基丁酸的对比见图2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.20.014.F002图27株红曲菌固态发酵产γ-氨基丁酸的对比由图2可知，7株红曲菌中紫色红曲菌ZH2产γ-氨基丁酸产量最高，其固态发酵产物中γ-氨基丁酸含量可达2.25 mg/g。其次为紫色红曲菌SJS-6，γ-氨基丁酸产量为1.46 mg/g。其余菌株固态发酵产γ-氨基丁酸的能力较弱。红色红曲菌9909固态发酵产γ-氨基丁酸能力最弱，γ-氨基丁酸产量仅为0.17 mg/g。紫色红曲菌ZH2固态发酵产γ-氨基丁酸的产量为红色红曲菌9909的13.24倍。有些红曲菌株在发酵过程中会产生桔青霉素，桔青霉素作为1种真菌毒素直接影响红曲产品的质量[19]。因此，用于生产γ-氨基丁酸发酵的菌株需要严格筛选，保证产品的安全性。对紫色红曲菌ZH2固态发酵产物中桔青霉素的含量进行检测，紫色红曲菌ZH2桔青霉素检测图谱见图3。图3紫色红曲菌ZH2桔青霉素检测图谱10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.20.014.F3a1（a）桔青霉素标准品10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.20.014.F3a2（b）紫色红曲菌ZH2发酵产物由图3可知，紫色红曲菌ZH2发酵产物中不含桔青霉素。因此，选用紫色红曲菌ZH2作为γ-氨基丁酸固态发酵菌株。2.3培养时间对紫色红曲菌ZH2固态发酵产γ-氨基丁酸的影响（见图4）不同的红曲菌、不同发酵条件最适γ-氨基丁酸周期不同[20-21]。因此，需要研究紫色红曲菌ZH2固态发酵产γ-氨基丁酸的最适发酵时间。由图4可知，随着培养时间的增加，紫色红曲菌ZH2的发酵产物中γ-氨基丁酸含量先增加后减少，产品收率随着发酵时间的增加随而减少。第2~8 d，γ-氨基丁酸快速积累，产品收率快速降低，可能因为在该段时间菌体快速生长，大量合成γ-氨基丁酸，γ-氨基丁酸积累较快。第8 d后，γ-氨基丁酸积累量开始减少，产品收率仍在降低，可能因为菌体将产生的γ-氨基丁酸用于自身合成或菌体生长。因此，紫色红曲菌ZH2最适的培养时间为8 d。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.20.014.F004图4培养时间对紫色红曲菌ZH2固态发酵产γ-氨基丁酸及产品收率的影响2.4不同接种量对红曲菌固态发酵产γ-氨基丁酸的影响（见图5）选用10%、15%、20%、25%、30%的种子液接入发酵瓶中，研究不同接种量对紫色红曲菌ZH2固态发酵产γ-氨基丁酸的影响。由图5可知，随着接种量增加，紫色红曲菌ZH2固态发酵产物中γ-氨基丁酸含量先升高后降低。且在接种量为25%时达到最高，其γ-氨基丁酸含量为2.83 mg/g。可能因为接种量过小时，菌株的适应期相对延长，发酵周期随之延长；接种量过大时，菌株前期生长迅速，前期大量营养物质会用于菌体生长，后期营养物质不充足，造成发酵周期相对缩短，且部分γ-氨基丁酸可能会被菌体自身消耗，对红曲菌固态发酵产γ-氨基丁酸造成一定影响[20]。因此，选用25%接种量较为合适。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.20.014.F005图5不同接种量对紫色红曲菌ZH2固态发酵产γ-氨基丁酸的影响2.5不同加水量对紫色红曲菌ZH2固态发酵产γ-氨基丁酸的影响（见图6）固态发酵基质几乎没有流动水，水分含量较低，一般在40%~60%之间[22-23]。但水分过低不利于菌丝生长，水分过高发酵基质容易结团，同样不利于红曲菌菌丝生长。因此，选用水分含量为8.8%的广西籼米作为固态发酵基质，分别添加25、30、35、40、45 mL双蒸水，使固态发酵基质初始含水量在40%~55%之间。由图6可知，随着加水量的增加，紫色红曲菌ZH2固态发酵产γ-氨基丁酸的产量先增加后减少，且当加水量为30 mL（即初始含水率为48.22%）时，γ-氨基丁酸产量达到最高，为3.43 mg/g。加水量为25 mL时，发酵结束后米粒分散均匀，但相对较为干燥，米粒中间仍有发白现象，说明菌丝并未长到大米内部。加水量超过30 mL时，稍微有结团现象，进行抖料会存在部分结块现象。加水量为30 mL时，大米几乎不结团，即使结团稍微抖料也可以分散开。因此，选用加水量为30 mL较为合理。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.20.014.F006图6不同加水量对紫色红曲菌ZH2固态发酵产γ-氨基丁酸的影响2.6不同温度对紫色红曲菌ZH2固态发酵产γ-氨基丁酸的影响（见图7）温度是影响微生物生长繁殖最为重要的因素之一[24]。红曲菌可在15~42 ℃生长[17]。温度对红曲菌发酵产γ-氨基丁酸有较大影响，且不同菌株、不同培养条件其最适发酵温度不同[20,25-26]。因此，需要研究紫色红曲菌ZH2固态发酵γ-氨基丁酸的最适温度。由图7可知，随着温度的上升，γ-氨基丁酸的产量先增加后减少，温度为25 ℃时，紫色红曲菌固态发酵产物中γ-氨基丁酸含量最高，为3.4mg/g。温度过低时酶活相对较低，酶反应速率较低造成低菌体生长较慢，发酵周期较长；在一定温度范围内随着温度升高酶活性随之增强，酶反应加快，生长周期也相对缩短。但是，温度过高又对酶活造成一定损伤，菌体生长过快，酶活过高也会使底物消耗过快，较多的营养物质用于菌体合成，到发酵后期营养物质不足也会对代谢产物积累造成较大影响[25]。因此，培养温度选择25 ℃较为适宜。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.20.014.F007图7不同温度对紫色红曲菌ZH2固态发酵产γ-氨基丁酸的影响2.7紫色红曲菌ZH2响应面优化结果根据单因素试验的结果和Box-Behnken中心组合试验设计原理，选取加水量、接种量及培养温度作为自变量，设计3因素3水平的响应面分析试验。响应面试验结果见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.20.014.T003表3响应面试验结果试验号A加水量/mLB接种量/%C温度/℃γ-氨基丁酸/(mg/g)实际值预测值13525201.772.0023025256.776.5533030202.342.2443025256.246.5553030302.903.2063025257.486.5573020202.662.3682525303.753.5293020302.142.24102525202.742.90113525302.392.22123025255.696.55133520251.982.05142530253.633.56153530251.941.81163025256.606.55172520252.352.48采用Design-Expert 8.0.1对试验结果进行二次回归拟合，将加水量、接种量和温度作为独立变量，γ-氨基丁酸含量为响应值（y）得到紫色红曲菌ZH2固态发酵产物中γ-氨基丁酸含量的回归方程：y=6.55-0.55A+0.21B+0.21C-0.33AB-0.098AC+0.27BC-1.96A2-2.12B2-1.93C 2。响应面试验方差分析见表4。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.20.014.T004表4响应面试验方差分析变量平方和自由度均方F值P值显著性R2= 0.965 6，R2Adj=0.921 3模型60.562 952 8496.729 216 98221.819 632 3800.000 3**A2.409 837 05312.409 837 0537.813 949 0420.026 7*B0.349 032 96610.349 032 9661.131 746 9820.322 7C0.347 310 96610.347 310 9661.126 163 3580.323 8AB0.436 663 01410.436 663 0141.415 889 3170.272 9AC0.038 542 98810.038 542 9880.124 976 4760.734 1BC0.294 508 10110.294 508 1010.954 948 9210.361 0A216.205 907 250116.205 907 25052.548 00 66400.000 2**B218.852 989 850118.852 989 85061.131 229 5100.000 1**C215.673 662 520115.673 662 52050.822 191 5300.000 2**残差2.158 813 58870.308 401 941失拟项0.405 415 14630.135 138 3820.308 289 0430.819 5不显著纯误差1.753 398 44340.438 349 611总值62.721 766 43016注：**表示影响极显著（P0.01）；*表示影响显著（P0.05）。由表4可知，回归模型显著（P0.05），失拟项不显著（P0.05），说明回归方程没有失拟，所以该模型可信度较高。因变量与自变量之间的线性关系显著R2=0.965 6，模型调整复相关系数R2Adj=0.921 3，说明该模型能解释92.13%相应值变化，总变异中仅有7.87%不能由该模型解释。故该模型与试验拟合良好，该回归方程能够用来描述各因素与响应值之间关系。3个因素对紫色红曲菌ZH2固态发酵产γ-氨基丁酸的交互影响的响应面分析见图8~图10。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.20.014.F008图8加水量与接种量对紫色红曲菌ZH2固态发酵产γ-氨基丁酸影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.20.014.F009图9加水量与温度对紫色红曲菌ZH2固态发酵产γ-氨基丁酸影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.20.014.F010图10接种量与温度对紫色红曲菌ZH2固态发酵产γ-氨基丁酸影响由图8~图10可知，曲面最高点均在响应面上，故各因素最优水平在所选范围之内。采用Design-Expert 8.0.1以γ-氨基丁酸产量最高为目的对模型进行优化，得到最优条件为加水量29.26 mL、接种量25.32%、培养温度25.32 ℃，此时γ-氨基丁酸含量达到6.61 mg/g。为了方便生产控制，选用含水量为8.8%的广西籼米作为固态发酵基质。在加水量30 mL、接种量25%、培养温度25 ℃、发酵培养8 d的条件下，γ-氨基丁酸产量达到6.55 mg/g。与预测结果的6.61 mg/g差异较小。因此，该模型预测值与试验值具有良好的拟合性。3结论确定紫色红曲菌ZH2固态发酵最适条件为加水量30 mL、接种量25%、培养温度25 ℃、发酵培养8 d。在此条件下，γ-氨基丁酸产量可以达到6.55 mg/g。