黄曲霉毒素（AFT）是1种主要由曲霉属真菌产生的有毒次生代谢产物，以二氢呋喃环和香豆素为基本结构，对人畜具有高致癌作用的肝毒素，长期接触可引起动物癌变和死亡[1-2]。黄曲霉毒素污染饲料或食品可能造成巨大的经济损失[3-4]。1AFB1对动物的危害以及动物饲料中AFB1的检测方法1.1AFB1对动物的危害黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）被国际癌症研究所归类为Ⅰ类致癌物。玉米、豆粕、花生等动物饲料原料中的AFB1含量超标可导致动物中毒，甚至死亡[5-8]。过量摄取含有黄曲霉毒素B1的原料会影响动物器官的正常代谢，造成动物机体免疫系统的紊乱，最终会对其肝脏、肾脏以及神经系统产生毒害作用[9]。黄曲霉毒素在光照、酸处理和热条件下具有良好的稳定性，裂纹温度为268 ℃，普通加工方式无法破坏[10]。动物饲料成分中AFB1的定性识别和定量分析可减少动物摄入量，对于动物饲料安全、环境健康、动物生长等方面均至关重要[11]。1.2动物饲料中AFB1的检测方法与特点饲料中AFB1含量的测定分析方法包括气相色谱法（GC）[12]、高效液相色谱法（HPLC）[13]、薄层色谱法（TLC）[14]、液相色谱串联质谱法（LC-MS）[15-18]等，具有准确性、高效性，但需要专门仪器，使用前需要学习专业操作技能，所需样本制备比较复杂且耗时。因此，研究人员开发了基于抗体的新型免疫分析法，如酶联免疫法（ELISA）[19-20]、胶体金免疫层析法（CGIA）[21-23]、电化学免疫分析法（ECIA）[24]、荧光偏振免疫分析法（FPIA）[25]。此类方法检测时间短、成本低、使用方便，能够分析多个样品，达到半定量或定量分析。但是在实际运用中可能会出现假阴性或假阳性反应，操作人员需要较高的专业素养[26]。2磁珠多色比色免疫测定法（MBMCIA）的原理和特点基于磁珠的多色比色免疫分析法（magnetic beads-based multicolor colorimetric immunoassay，MBMCIA）检测饲料中AFB1的方法具有良好的高分辨率，裸眼检测AFB1效果，此法已在现场诊断中得到广泛的关注。2.1MBMCIA的原理MBMCIA利用试剂活化磁珠（MBs），活化后的MBs经过洗涤形成MBs适配体结合物，能够高效捕获待检测物质，待检测AFB1的物质特异性吸附在MBs表面，进行下一步催化引发随后的多色反应或直接检测[27]。MBMCIA测定AFB1时，通过将MBs与碱性磷酸酶（ALP）介导的金核受体上的银沉积整合到免疫测定中。通过反应活化MBs，MBs上经过活化的羧基通过辛酸硫酸铵反应偶联MBs形成MBs-AFB1-BSA适配体。待检饲料中存在AFB1时，AFB1与MBs-AFB1-BSA竞争性首先识别AFB1，L-抗坏血酸-2-磷酸钠（AA-P）不能被ALP诱导触发催化反应，反应呈现金纳米颗粒的原色淡红棕色。待测样品中目标AFB1完全结合或待测样品中缺乏AFB1的情况下，适配体进行识别，ALP被固定在MBs上，ALP可催化水解AA-P生成抗坏血酸（AA）。生成的AA可以作为还原剂还原银离子，从而将金属银沉积在金纳米棒（Au NRs）上生成银包金纳米粒子（Au@Ag NRs）（见图1）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.20.027.F001图1MBMCIA检测AFB1的作用原理注：EDC为1-乙基-3-碳二亚胺盐酸盐；NHS为N-羟基琥珀酰亚胺；BSA为牛血清白蛋白。根据在Au NRs上的ALP介导还原产生的银沉积的多少，Au NRs的纵横比不同程度地变小，纵横比变化引起纵向局域表面等离子体共振（LSPR）吸收峰，以不同目标颜色的多色变化确定AFB1含量的多少[28]。2.2MBMCIA作用于饲料检测中的特点MBMCIA的新颖点在于通过MBs、Au@Ag NRs、多色比色的三重作用，将不敏感的传统信号转化成为肉眼可分辨的多色变化信号，可在裸眼下完成对饲料中AFB1的基本定量分析。MBMCIA融合4种功能成分：用于富集饲料样品中AFB1的MBs、用于多色显色的底物Au NRs、用于特异性识别的AFB1单克隆抗体、用于连接免疫分析和显色反应的ALP。因此，MBMCIA能够识别、分离、富集和目视分析饲料中的AFB1。常规的比色免疫分析使用颜色作为报告标志。目标分子存在的情况下，只显示单色强度的变化，导致报告标志不适用于资源受限区域中的现场裸眼检测，单色响应分辨率低[29]。利用多色比较法可使饲料中AFB1的剂量依赖多色策略，提高目测检查的准确性和检测分辨率。MBMCIA采用MBs代替微孔板作为固定相，因为MBs具有较大的比表面积，能够在反应混合物中自由扩散，且易于分离。MBs具有丰富的表面功能化基团，能够固定大量的小分子物质，如抗体[30]。免疫反应的作用范围从平面变为立体的MBs，进一步富集信号物质，提高免疫测定的灵敏度，缩短检测时间[31-32]。MBs还具有成本低、分离速度快、表面易于修饰、灵敏度高、选择性广泛等优点，在生物检测领域具有重要作用。MBs可借助外部磁性轻松从复杂溶液中分离，并收集分析物，提供稳定的固相载体，利于外部分离操作，消除饲料样品基质的干扰[33-34]。最后，MBs可利用磁分离技术达到回收再利用的目的，回收率可达到95%以上[35]。Lerdsri等[36]研究发现，利用1种ALP介导的银粒子在Au NRs表面上沉积银纳米壳的方法，结果表明，MBMCIA利用ALP介导的银沉积生成Au NRs，检测饲料中极低含量的AFB1，并记录紫外-可见光谱（UV-VIS）和颜色变化图像。分别在无ALP的条件下与加入ALP的条件下纵向LSPR峰发生明显移动的现象，表明AA-P在ALP的作用下水解得到的AA是该方法的关键，可使银离子形成Au@Ag NRs，导致Au NRs的长径比降低，并伴随着溶液一系列的多色变化，从最初的红棕色到绿色、青色、蓝色、紫色，再到橙色、红色。不同的颜色变化是由不同的沉积量导致的粒子纵横比变化，能够反映所测物质的含量[37]。3MBMCIA检测AFB1的研究与应用MBs被越来越多地运用于免疫法检测饲料中的AFB1。创建酶联免疫吸附试验是检测领域常用的生化技术，磁性微珠的使用已引起了生物分析和检测领域的极大关注[38]。MBs对靶目标分子特异性和识别性差，但适配体能够有效解决。适配体可识别各种靶标分子，并与其高特异性、高稳定性结合[39]。古鑫宇等[40]研究发现，通过构建特异性识别AFB1的MBs适配体，运用高效液相色谱法，建立1种食品或饲料中AFB1的定量检测方法。被检测的样品中AFB1浓度在0.25~25.00 μg/L，呈良好的线性关系，相关系数R2=0.999，定量检出限为0.25 μg/L，可改善上述问题。但是，适配体的装配方法较为复杂，有待进一步优化。贵金属纳米粒子基于金等贵金属的显色反应而生，消光系数高于传统染料（如TMB），具有出色的LSPR吸收信号报告。有关金属离子显色方面的应用，除上文提到的银离子沉积法改变纳米微粒的纵横比外，还可使用酶辅助蚀刻方法。酶辅助蚀刻方法以Au NRs作为等离子酶联免疫吸附测定（pELISA）的输出信号，可定量或定性检测玉米样品中的AFB1[41]。采用AFB1标记的葡萄糖氧化酶作为竞争性抗原，催化葡萄糖转化为过氧化氢，使用辣根过氧化物酶催化过氧化氢，产生羟基，使羟基自由基化学腐蚀Au NRs，纵横比变大[42]。使650 nm处溶液的光密度降低，液体产生从蓝绿色到红色的颜色指示变化，肉眼无法精确定量，可通过酶标仪对AFB1进行定量分析。此方法对定量AFB1检测具有极高的灵敏度，可见的临界值为12.5 ng/L。该技术实现了定量AFB1分析，在3.1~150.0 ng/L含量的良好线性范围，最大半数抑制浓度为22.3 ng/L，约低于常规ELISA检测方法的32倍。但是，存在目标颜色分辨率低以及蚀刻Au NRs时间较长的问题[43]。比色免疫测定法被认为是确定靶分子的有效方法，具有操作简便、成本效益高、灵敏度高、结果直观等优点，广泛用于饲料样品的即时现场快速测定[44]。比色免疫测定的关键点主要取决于催化剂将目标检测物浓度转换为颜色变化的能力。Tang等[45]报告1种食品中AFB1的敏感比色免疫分析法。此法利用AA还原原理，最佳检测条件下，溶液中415 nm处的吸光度随着AFB1浓度增加而线性增加，范围为10 ng/L~100 μg/L，颜色逐渐由浅绿色变为深绿色，两者具有良好的线性关系（R2=0.999 1），检测极限为7.8 ng/L，但颜色单一无法目检。有研究表明，最佳条件下，MBMCIA对饲料中的AFB1检测具有良好的灵敏度和特异性，检出限低至5.7 ng/L，在0.01~10.00 μg/L动态范围内，纵向LSPR峰与AFB1浓度之间显示出良好的线性关系，R2=0.986 6，回收率为99.1%~104.3%，相对标准偏差小于7.05%[46]。Wang等[28]研究发现，同样利用生物功能化MBs和Au NRs建立了检测AFB1的竞争比色免疫分析方法与MBMCIA相似，采用AFB1-BSA偶联物被用作捕获探针，可通过免疫反应与抗AFB1抗体特异性结合。优化后蛋白大小、孵育时间和酸碱度的变化对反应造成影响，使该方法可以在20～800 ng/L的线性范围内检测AFB1，检出限为12 ng/L，玉米样品的回收率为92.8%~122.0%，UV-VIS检测下吸收强度与AFB1浓度成正比。4MBMCIA检测的优势与展望MBMCIA采用MBs固定。MBs作为规则球体，与传统方法比，具有较高的比表面值和良好的生物相容性，可负载更多的生物活性分子，如抗体[47]、酶[48]和DNA[49]等，可以进一步提高检测精度。由于MBs固有的磁性，使用后可借助磁性装置分离回收[50]。凭借这一独特优势，使得具有良好的免疫测定相关领域发展前景。利用传统方法检测AFB1时，前期需要大量复杂的富集纯化步骤。为了便于后续检测试验，MBs可富集化AFB1，解决上述问题[51-52]。利用MBs可综合其他检测方法，将优化MBs以及联合使用作为未来免疫测定法研究的新方向，使传统免疫法获得更低的检测限度和更短的检测时间。当抗体的免疫反应性和方向最佳、非特异性吸附最小时，MBs可提供更高的选择性[53-54]。LSPR现象拥有定量可视化、快速现场定量检测等优点。Au NRs的使用不仅提高饲料安全监控中的AFB1检测的灵敏度，还可为赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEA）、短裸甲藻毒素B（brevetoxin B，BTX-B）等其他饲料中经常存在的霉菌毒素或污染物的定性或定量检测提供改进策略和新的研究方向[55-56]。但是，MBMCIA存在免疫源单一的局限性，对其他饲料中毒素的测定，需要使用与其毒素相对应的单克隆抗体来替换之前整合在配合体上的AFB1抗体才可完成。MBMCIA采用肉眼可辨别的多色进行比较。虽采用多个颜色作为报告信号，但却是狭义上的多色，以单一颜色的不同深浅程度作为被测物质含量多少的标准，不借助仪器设备无法准确确定颜色变化程度，达到定性分析的目的。颜色的分辨程度和分辨率低等问题需要改进，多色比较法能够更直观、明显地表现饲料样品中AFB1的含量[57]。由于同时整合多种单克隆抗体的难度较高，多克隆抗体易受到其他因素干扰，对同时测定饲料中所含上述不同种类毒素的多色显色法尚无报道，因此是未来相关研究的热门方向。多色比色法研究的新兴领域，有待深入研究。5结论MBMCIA操作方法方便简洁，检测结果快速精确，并且具有便携、可视化、高灵敏度、可回收重复使用等优点，能够达到现场定量检测饲料中AFB1的目的，为研究饲料中污染物的分析提供帮助。虽然当前该技术还未大范围使用，但MBs、Au NRs显色法、多色比色法等检测方法均已广泛应用于饲料和生物检测技术等领域。该方法虽然操作方便快捷，但是在MBs适配体和反应体系的制备方面需要做一些前期复杂的装配工作，更简洁的配合方法和其他领域的潜在价值有待进一步的研究。MBMCIA基于免疫，抗体具有专一性，若优化MBMCIA达到同时检测多种毒素的效果，需在MBs适配体上配合多种不同抗体或新型抗体，继续创新与完善。