木聚糖酶是由β-1，4-内切木聚糖酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡萄糖苷酶和β-木糖苷酶、阿魏酸酯酶、乙酰木聚糖脂酶、外切-β-木聚糖酶等组成的复合酶，可使木聚糖水解成低聚木糖或木糖。木聚糖主链内部的β-1，4糖苷键可被内切木聚糖酶随机水解成低聚木糖，降低木聚糖聚合度[1-5]。外切木聚糖酶在木聚糖非还原性末端逐一切下木糖残基，经余下3种酶协同作用，木聚糖完全分解。木聚糖酶可水解饲料中木聚糖成分，提高饲料的利用率及营养价值；木聚糖酶可用于漂白纸浆，减少对环境的污染；木聚糖酶可用于生产功能性木寡糖以及改善面包品质等[6-14]。产木聚糖酶的微生物种类众多，主要为真菌和细菌。真菌包括曲霉属（Aspergillus）、青霉属（Penicillium）、木霉属（Tirichode）、酵母属（Saccharomycetes）等[15-19]，细菌包括芽孢杆菌属（Bacillus）、链霉菌（Streptomycete）、大肠杆菌（Escherichia coli）等[20-24]。木聚糖酶可根据酸碱耐受不同分为酸性和碱性木聚糖酶[25-29]。木聚糖酶酶促反应的最佳温度为40~60 ℃，最佳pH值为4~7[1-4,15-18]。本试验以木聚糖为筛选平板，筛选1株耐高温木聚糖酶产生菌，完成菌种鉴定。以甘蔗渣为碳源，固体发酵后离心获得粗酶液，研究温度、pH值、金属离子对酶促反应速率的影响，获得试验菌株木聚糖酶的酶学性质，为木聚糖酶的应用提供参考。1材料与方法1.1样本采集采集宜州区太平乡高温堆积的蚕沙中部5 cm以下的土样100 g，采样袋密封，备用。1.2培养基筛选培养基[30]：0.2%木聚糖、0.2% (NH4)2SO4、2%琼脂、0.05% MgSO4·7H2O、0.1% KH2PO4、0.05% NaCl、1 L蒸馏水。固体发酵培养基[31]：4 g麸皮、6 g蔗渣、30 mL Mandels营养盐液。察氏培养基：0.05% MgSO4·7H2O、0.2% NaNO3、2%琼脂粉、0.05% KCl、0.1% K2HPO4、3%蔗糖、0.01% FeSO4·7H2O、1 L蒸馏水。1.3试验方法1.3.1产耐高温木聚糖酶菌株的筛选初筛：10 g蚕沙加无菌水至100 mL，180 r/min、30 ℃摇床振荡30 min，稀释至10-6，各取100 μL涂布于筛选培养基，50 ℃倒置培养4 d。根据透明圈法挑选目标菌株，接种至察氏培养基斜面纯化，备用。复筛：纯化的斜面菌种配成107孢子浓度的悬液，取2 mL加入固体发酵培养基，50 ℃培养4 d，添加200 mL纯净水，4 ℃、6 000 r/min离心10 min，得到粗酶液。根据酶活性大小进行复筛。1.3.2酶活测定参照Miller[32]酶活测定方法进行测定，并根据公式计算酶活。在pH值4.8，50 ℃的条件下，以每分钟催化木聚糖水解生成1 μmol木糖所需的酶量定义为1个酶活性单位。1.3.3产耐高温木聚糖酶菌株的鉴定菌落特征观察：外观形态、菌落颜色、含水状态等。显微观察：孢子形状、大小，细胞间有无隔膜等。ITS序列分析：选取培养2~3 d且生长状况良好的菌株平板，PCR扩增ITS序列，送至上海生工生物工程技术服务有限公司测序。1.3.4木聚糖酶最适反应温度及温度稳定性使用移液枪吸取1.5 mL 1%木聚糖溶液，依次加入7支25 mL比色管中，30~80 ℃水浴预热2 min。加入0.5 mL稀释100倍的粗酶液，准确反应20 min，加入3 mL DNS煮沸5 min。流水冷却，定容至25 mL，待溶液稳定后各吸取200 μL，于酶标仪540 nm处测定OD值，最高酶活为100%；将粗酶液和底物混合，分别在30~80 ℃的水浴锅中保温2 h，测定酶活。1.3.5木聚糖酶的最适pH值及pH值稳定性粗酶液和木聚糖使用pH值3~8的Na2HPO4-C6H8O7缓冲液稀释成100倍，配制成1%的底物，最适温度进行20 min酶促反应。按1.3.2方法测定酶活性，以最高者为100%，重复3次，取平均值；将稀释好的粗酶液加入pH值为3~8的Na2HPO4-C6H8O7缓冲体系中，最适温度下保温2 h，测定540 nm处的OD值，计算酶活。1.3.6金属离子对木聚糖酶酶活性的影响取12支干净的刻度比色管，吸取1.5 mL的1%木聚糖溶液放入刻度比色管内，分别加入0.5 mL 10 mmol/L的Fe2＋、Cu2＋、Ca2＋、Na＋、Ba2＋、Cd2＋、Li＋、Al3＋、K＋、Zn2＋、Mn2＋、Co2＋溶液和0.5 mL稀释100倍的粗酶液，最适条件下反应20 min，以不添加金属离子溶液的酶活为100%。测定540 nm处的OD值，计算酶活。2结果与分析2.1木聚糖筛选培养基筛选结果（见图1）由图1可知，采用透明圈法，从高温堆积的蚕沙筛选到1株能够分解木聚糖的菌株。将其转接到察氏培养基纯化，以便后续发酵产酶使用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.20.013.F001图1木聚糖筛选培养基筛选结果2.2耐高温木聚糖酶产生菌TP-1的菌落形态（见图2）由图2可知，菌株在筛选培养基生长2 d长出大量白色菌丝体；第3 d长出大量孢子，孢子为淡黄色。菌落大而疏松、丝状交织、外观干燥。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.20.013.F002图2耐高温木聚糖酶产生菌TP-1的菌落形态2.3光学显微镜下菌株TP-1的孢子（见图3）由图3可知，菌株TP-1孢子呈椭圆形，分生孢子梗上长有大量孢子，成熟后连串散落，且基内菌丝长有隔膜。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.20.013.F003图3光学显微镜下菌株TP-1的孢子（400×）2.4菌株ITS扩增图和系统发育树（见图4、图5）由图4可知，PCR扩增ITS序列获得约800 bp片段，NCBI比对获得序列相近菌种序列，采用邻近法构建菌株系统发育树。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.20.013.F004图4菌株ITS扩增图注：1为ITS序列，M为DNA分子量标准DL 2000 Marker。由图5可知，看出菌株TP-1与Thermomyces dupontii基因序列的相似性为99%，初步鉴定菌株TP-1为杜邦嗜热菌（T. dupontii）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.20.013.F005图5产耐高温木聚糖酶菌株TP-1的系统发育树2.5菌株TP-1所产木聚糖适温度及温度稳定性（见图6）由图6可知，嗜热杜邦菌所产的木聚糖酶在60 ℃时酶活最高，之后逐渐下降，说明60 ℃是酶促反应的最佳温度。pH值为4.8，温度50~70 ℃的条件下保温2 h，仍能保持较高的活性，表明该酶有良好的热稳定性。图6菌株TP-1所产木聚糖适温度及温度稳定性10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.20.013.F6a1（a）菌株TP-1所产木聚糖的最适温度10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.20.013.F6a2（b）菌株TP-1所产木聚糖的温度稳定性2.6菌株TP-1所产木聚糖最适pH值及pH值稳定性（见图7）60 ℃条件下，粗酶液可与不同pH值配制的底物反应。由图7可知，木聚糖酶最适作用pH值为5.0。pH值为4~6的条件下保温2 h，仍能够保持75%以上的活性。图7菌株TP-1所产木聚糖最适pH值及pH值稳定性10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.20.013.F7a1（a）菌株TP-1所产木聚糖的最适pH值10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.20.013.F7a2（b）菌株TP-1所产木聚糖的pH值稳定性2.7金属离子对木聚糖酶酶活性的影响（见图8）由图8可知，与空白组相比，加入Fe2＋、Ba2＋、Mn2＋的木聚糖酶相对酶活分别是165.20%、140.00%、147.50%，可增强木聚糖酶的活性。加入Co2＋的木聚糖酶相对酶活为70.84%，能够降低木聚糖酶的活性。其他离子对酶活几乎无影响。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.20.013.F008图8金属离子对木聚糖酶酶活性的影响3结论以木聚糖为底物，通过透明圈法从高温堆积的蚕沙中筛选1株耐高温木聚糖酶产生菌TP-1。经菌落特征观察、显微观察和ITS序列分析，初步鉴定为杜邦嗜热菌TP-1。将杜邦嗜热菌TP-1接种至以蔗渣、麸皮为碳源的固体发酵培养基，50 ℃发酵4 d，杜邦嗜热菌TP-1所产的木聚糖酶最适作用温度为60 ℃，最适作用pH值为5。粗酶液在最适条件下酶活为75.96 U/g。10 mmol/L的Fe2＋、Ba2＋、Co2＋可增强木聚糖酶的活性，10 mmol/L的Mn2＋能够降低木聚糖酶的活性。酶学性质初步研究表明，该酶在较高温度和较低pH值条件下，酶活性较高。在饲料加工中一般利用酸性、耐高温的木聚糖酶，而杜邦嗜热菌所产木聚糖酶恰好满足这个条件。后期可以利用综合试验设计方法，对杜邦嗜热菌TP-1接种量、培养时间、摇床转速、碳源、氮源等培养基经行优化，探索出最佳的产酶条件。再对粗酶液进行分离纯化，以获得电泳纯的木聚糖酶，并完成酶学性质研究。运用分子生物学、基因工程及酶工程技术，研究所得木聚糖酶的蛋白质结构与功能、催化机制、耐热机制，为木聚糖酶资源的充分利用和工业化生产提供试验基础。