栗木单宁（chestnut tannic，CHT）是最常见的植物提取单宁酸。单宁酸（tannic acid，TA）又称为没食子酸，是1种对脂质过氧化具有强抗氧化能力的多酚类物质[1]。单宁被视为抗营养因子。研究表明，低剂量单宁可提高动物生长性能，改善机体抗氧化状态，调节肠道微生态平衡[2]，是1种潜在抗微生物生长促进剂[3]。单宁酸在奶牛[4]、仔猪[5]、肉鸡[6]、家兔[7]等生产中均有较好的应用效果。但有关水产动物饵料中添加单宁酸对生长、消化吸收及抗氧化指标等方面影响的研究较少。研究表明，海鲈、石斑鱼饵料中添加水解单宁，具有一定的促生长及改善肠道菌群结果的作用[8-9]。郭慧等[10]研究发现，水解单宁可促进对虾生长，并且能够改变其肠道菌群结构。作为1种新型添加剂，单宁酸的应用效果可能受来源、剂量、环境等多方面因素的影响。本试验旨在研究不同浓度的栗木单宁对凡纳滨对虾生长、消化酶、血清抗氧化及肠道菌群结构的影响，以期为单宁酸在水产动物生产中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料试验使用的栗木单宁由意大利Silvateam公司提供。1.2试验设计试验于广东恒兴日粮实业股份有限公司863基地进行。选取360尾初始体重在（0.76±0.01）g的健康凡纳滨对虾虾苗饲养于玻璃纤维箱（300 L），分为4组，每组3个重复（以每个玻璃纤维箱为1个重复），每个重复30尾对虾。各组分别添加0、300、600、900 mg/kg的栗木单宁制成4组试验饵料，标记为对照组、TA300组、TA600组和TA900组。基础饵料由多功能螺旋挤压机（CD4XITS，中国广州华南理工大学）制成，55 ℃烘干过夜，-20 ℃密闭储存。基础饵料组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.20.008.T001表1基础饵料组成及营养水平项目对照组TA300组TA600组TA900组原料组成鱼粉28.0028.0028.0028.00豆粕27.0027.0027.0027.00花生饼15.0015.0015.0015.00面粉21.5021.4721.4421.410乌贼膏3.003.003.003.00大豆卵磷脂2.002.002.002.00鱼油1.501.501.501.50多维0.500.500.500.50多矿0.500.500.500.50磷酸二氢钙1.001.001.001.00栗木单宁00.030.060.09合计100.00100.00100.00100.00营养水平粗蛋白质48.3147.4447.2847.85粗脂肪6.217.827.197.67粗灰分9.329.279.089.33注：1.每千克多维为基础饵料提供：VA 161 500 IU、VD 80 000 IU、VE 0.8 g、VK3 0.2 g、VB1 0.2 g、VB2 0.4 g、VB6 0.24 g、VB12 0.000 8 g。2.每千克多矿为基础饵料提供：烟酸1.4 g、泛酸钙0.8 g、生物素0.003 2 g、叶酸0.064 25 g、肌醇2 g、VC-磷酸盐（35%）50 g、氧化胆碱（65%）100 g、钙57.5 g、钾9 g、镁2.25 g、铁2.5 g、锌2 g、锰0.475 g、铜0.375 g、钴0.062 5 g、碘0.008 g、硒0.015 g。3.营养水平均为实测值。%1.3饲养管理每天投喂3次（6：00、13：00和18：00），根据凡纳滨对虾生长情况适当调整投喂量，试验持续50 d。1.4测定指标与方法1.4.1生长性能饲养试验结束，试验凡纳滨虾禁食24 h后取样。以桶为单位称重并记录凡纳滨虾总数，计算增重率、成活率、蛋白质效率、特定生长率以及饵料系数。增重率=(末重-初重)/初重×100%(1)成活率=末尾数/初尾数×100%(2)蛋白质效率=(末重-初重)/蛋白摄入量×100%(3)特定生长率=[ln(末重)-ln(初重)]/试验天数×100%(4)饵料系数=饵料摄入量/(末重-初重)(5)1.4.2体组成分随机抽取8尾虾，4 ℃保存，待测体组成。饵料及全虾水分、粗蛋白、粗脂肪和灰分含量均参照AOAC（1995）测定方法进行测定。1.4.3消化酶活性、血清免疫指标及抗氧化指标随机抽取10尾虾，头胸部与腹部间处采集虾血，放入2 mL离心管，4 ℃保存过夜。8 000 r/min离心10 min，取血清。选取其中6尾虾取肝胰腺，清洗后装入防冻管，并放入液氮罐，-20 ℃保存。测定对虾肝胰腺脂肪酶（LPS）、淀粉酶（AMS）和蛋白酶（TRS）活性以及血清中的碱性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶（ACP）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）活性和总抗氧化能力（T-AOC）。试剂盒购自南京建成生物工程研究所，检测方法严格按照说明书进行操作。1.4.4肠道菌群余下4尾采血的虾使用75%酒精擦拭体表，完整取出肠道，使用0.9%无菌生理盐水冲洗肠道外壁，装入防冻管，并放入液氮罐，-20 ℃保存。使用16S rDNA基因V3、V4高变区特异性引物338F和806R对细菌基因组DNA进行扩增。通过Illumina MiSeq平台对肠道菌群进行高通量测序。原始数据经处理得到优化序列，对获得的不同相似度水平序列，按97%的相似水平进行OTU划分。基于OTU进行alpha多样性使用QIIME（V1.9.1）分析菌群丰度（Chao指数、ACE指数）和菌群多样性（Shannon指数、Simpson指数）。按照OUT的注释划分不同分类地位鉴定结果，进行群落结构的统计分析，检测对照组、TA300组、TA600组和TA900组菌群丰度差异。1.5数据统计与分析数据采用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析（One-way ANOVA），采用Duncan's法进行多重比较，结果以“平均值±标准误”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1栗木单宁对凡纳滨对虾生长性能的影响（见表2）由表2可知，各处理组成活率均接近100%，且生长速度较快。饵料中添加不同浓度的栗木单宁对凡纳滨对虾生长性能未造成显著影响（P0.05），但TA300组对虾增重率、特定生长率、蛋白质效率均为最高，饵料系数最低。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.20.008.T002表2栗木单宁对凡纳滨对虾生长性能的影响组别初重/g末重/g增重率/%特定生长率/(%/d)蛋白质效率存活率/%饵料系数对照组0.76±0.0011.73±0.431 443.28±62.355.47±0.081.55±0.0498.89±1.921.34±0.03TA300组0.76±0.0012.18±0.161 505.99±29.465.55±0.041.64±0.03100.00±0.001.28±0.02TA600组0.76±0.0112.07±0.181 486.69±23.515.53±0.031.61±0.0198.89±1.921.31±0.01TA900组0.76±0.0012.08±0.241 479.78±32.675.52±0.041.59±0.0997.78±3.851.32±0.08注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.2栗木单宁对凡纳滨对虾体组成的影响（见表3）由表3可知，各组间凡纳滨对虾的水分、蛋白和灰分含量无显著差异（P0.05）。TA300组、TA600组凡纳滨对虾的粗脂肪含量显著高于TA900组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.20.008.T003表3栗木单宁对凡纳滨对虾体组成的影响（湿重）组别水分粗蛋白粗脂肪灰分对照组72.26±1.1919.45±0.481.70±0.13ab3.06±0.11TA300组72.65±0.5719.28±0.301.91±0.07a3.02±0.14TA600组72.75±0.3019.57±0.211.85±0.04a3.05±0.15TA900组72.76±0.3019.11±0.331.59±0.17b3.18±0.05%2.3栗木单宁对凡纳滨对虾肝胰腺消化酶活性的影响（见表4）由表4可知，栗木单宁对凡纳滨对虾肝胰腺淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶活性无显著影响（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.20.008.T004表4栗木单宁对凡纳滨对虾肝胰腺消化酶活性的影响组别淀粉酶蛋白酶脂肪酶对照组296.41±82.492 429.77±430.3550.73±1.78TA300组313.61±90.632 094.02±68.7252.15±7.24TA600组196.85±29.002 358.86±495.5244.09±4.98TA900组236.81±46.882 126.88±455.5148.22±7.74U/mg2.4栗木单宁对凡纳滨对虾血清免疫、抗氧化指标的影响（见表5）由表5可知，与对照组相比，TA600组、TA900组的血清AKP、ACP和CAT活性均显著降低（P0.05）。添加栗木单宁对凡纳滨对虾血清SOD活性、T-AOC均无显著影响（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.20.008.T005表5栗木单宁对凡纳滨对虾血清免疫和抗氧化指标的影响组别AKPACPCATT-AOCSOD对照组32.12±5.15a50.64±11.78a11.79±2.49a121.69±1.4634.14±4.97TA300组32.47±15.72a17.23±4.80b8.13±1.72b122.22±0.5232.04±8.02TA600组16.01±5.76b14.51±0.52b6.61±0.73b121.52±0.8720.54±4.26TA900组12.18±3.57b30.28±7.02b7.26±1.54b121.07±2.2425.96±12.46U/mL2.5栗木单宁对凡纳滨对虾肠道菌群结构的影响（见图1、图2、表6、表7）由图1可知，对照组、TA300组、TA600组和TA900组独有OTU数量分别为51、24、43和68，共享的OUT数量为167，分别占各处理组总OUT的48.83%、53.02%、52.68%和47.04%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.20.008.F001图 1OUT样本分布Venn图由表6可知，TA300组的ACE指数显著高于TA600组（P0.05），说明TA300组有较高的菌群丰度。Shannon指数及Simpson指数反映菌落的多样性，各组间均无显著差异（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.20.008.T006表6栗木单宁对凡纳滨对虾肠道菌群alpha多样性的影响组别Chao指数ACE指数Shannon指数Simpson指数对照组0.97±0.03279.02±2.06ab2.72±0.230.15±0.04TA300组1.00±0.02325.77±48.54a3.19±0.120.09±0.02TA600组1.04±0.03245.71±12.28b3.03±0.290.10±0.04TA900组0.96±0.04284.33±50.22ab2.71±0.430.18±0.10由图2可知，对照组、TA300组、TA600组和TA900组的主要菌群分别为变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidota）、厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteriota）和疣微菌门（Verrucomicrobia）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.20.008.F002图2栗木单宁各试验组样品在门水平上的物种丰度由表7可知，随栗木单宁添加量升高，变形菌门比例逐步降低，拟杆菌门比例逐步增加。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.20.008.T007表7栗木单宁对凡纳滨对虾肠道菌群结构的影响组别变形菌门拟杆菌门厚壁菌门放线菌门疣微菌门对照组52.81±20.9041.03±18.824.55±3.011.15±0.730.29±0.11TA300组49.61±5.4341.41±4.625.39±2.701.57±0.701.10±0.69TA600组49.77±8.9642.44±8.095.97±1.850.90±0.420.38±0.36TA900组40.34±8.6352.22±10.033.84±1.722.10±1.870.90±0.723讨论3.1栗木单宁对凡纳滨对虾生长性能的影响因养殖的种类、单宁的类型和用量不同，单宁对水生动物生长产生不同的影响。研究发现，肉鸡日粮中添加低剂量的栗木单宁（0.15%~0.20%）有利于提高肉鸡的生长性能[11]。邓文等[12]研究发现，将1 000 mg/kg的栗树单宁添加到断奶猪仔日粮中，可以显著提高仔猪日增重，改善生长性能。本研究将栗木单宁添加到凡纳滨对虾的饵料中，TA300组凡纳滨对虾的增重率、特定生长率、蛋白质效率均高于其他组，饵料系数低于其他组，但未达到显著水平。随着栗木单宁添加量升高，试验凡纳滨对虾的存活率均较高，说明添加量为300~900 mg/kg栗木单宁对凡纳滨对虾养殖无不良的影响。本试验结果与郭慧等[10]添加同浓度的单宁的研究结果不同，可能是由于水解单宁与本试验使用的栗木单宁的成分不一样所致。郭慧等[10]研究发现，凡纳滨对虾的成活率在56%~78%。本研究中，对虾成活率均在97%以上。3.2栗木单宁对凡纳滨对虾体组成的影响研究表明，单宁可提高虹鳟的鱼体粗蛋白含量，降低鱼体的脂肪及水分含量[13]。本试验在饵料中添加栗木单宁对凡纳滨对虾的水分、粗蛋白和灰分无显著性影响，但添加900 mg/kg栗木单宁组对虾的粗脂肪含量显著低于其他添加组。3.3栗木单宁对凡纳滨对虾消化酶活性的影响本试验中，栗木单宁对凡纳滨对虾肝胰腺的淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶均无显著影响。有研究表明，单宁不仅影响蛋白酶的活性，也在较大程度上抑制脂肪酶的活性，但对淀粉酶的活性影响较小[14]。Lee等[15]研究表明，单宁对鲻鱼的体外胰蛋白酶活性具有非竞争的混合抑制作用。Nyman等[16]研究表明，小鼠日粮中添加2.5%的水解单宁可显著降低消化道脂肪酶活性。李军辉等[17]研究发现，日粮中添加水解单宁可显著提高肉鸡胰蛋白酶活性。上述研究结果之间存在一定差异，可能与单宁种类、来源、添加量及养殖品种有关。3.4栗木单宁对凡纳滨对虾血清免疫、抗氧化指标的影响动物在进行新陈代谢时会产生活性氧（ROS），过量的ROS可能导致细胞功能丧失，甚至引起细胞凋亡或坏死[18]。SOD将超氧阴离子自由基转化为过氧化氢，从而消除活性氧毒害；CAT可以有效清除过氧化氢，维持免疫系统的氧化还原平衡；T-AOC可以反映各类抗氧化物质的总抗氧化水平。单宁是1种抗氧化剂，其抗氧化活性的基本机制主要为清除自由基、螯合过渡金属和抑制氧化酶活性[19]。在罗非鱼饵料中添加166 mg/kg单宁可提高生长性能，改善免疫能力[20]。本试验结果表明，饵料中添加栗木单宁可显著降低CAT活性，增强抗氧化能力，机体不必过度调动CAT的生物活性；虽然单宁添加对T-AOC和SOD的活性无显著影响，但SOD活性随着单宁浓度升高有降低趋势。有研究发现，单宁超过一定的浓度范围可以提高细胞中游离的Fe3+和Fe2+的含量，产生超氧阴离子自由基和羟基自由基，将抗氧化能力转变为促氧化，降低机体抗氧化酶活性[21]。ACP和AKP是反映甲壳类动物免疫功能的重要指标，是体内抵抗病原微生物的重要非特异性免疫酶。有研究表明，ACP和AKP对溶酶体的吞噬起重要作用[22]。刘蕾[23]研究发现，饵料中添加水解单宁可提高鳙鱼血清AKP活性。朱旭枫等[9]研究发现，饵料中添加水解单宁可降低珍珠龙胆石斑血清和肝脏的ACP和AKP的活性。目前鲜见有关单宁对凡纳滨对虾ACP和AKP活力影响及其作用机制研究的报道。本试验在饵料中添加栗木单宁，凡纳滨对虾的ACP和AKP活性均显著降低，表明添加栗木单宁对凡纳滨对虾的免疫能力存在消极影响。3.5栗木单宁对凡纳滨对虾肠道微生物菌群的影响单宁可与金属离子形成不溶性络合物。Scalber[24]研究发现，单宁酸通过减少铁离子的含量实现抗菌活性。培养基中的单宁酸能够螯合培养基中的铁，使其不能被微生物增殖利用。金属离子的缺乏可能会影响微生物细胞中金属酶的活性，而螯合的矿物质（铜、钴和铁）可能会降低微生物的代谢效率及附着于各种底物的能力，影响活性酶复合物分泌[25]。与陆生动物不同，水生动物直接暴露在大量微生物中[26]。虾的防御机制主要取决于非特异性免疫系统，活性细菌可通过其代谢产物或与宿主肠道上皮层的相互作用，刺激水生动物的免疫和生理反应[26]。本试验通过Miseq测序分析，探究栗木单宁对凡纳滨对虾肠道菌群的微生物群落的影响。结果发现，TA300组的ACE指数显著高于TA600组。ACE指数是评估物种总数的常用指数，Shannon指数是评估群落多样性的指数。本研究表明，添加300 mg/kg栗木单宁对凡纳滨对虾肠道菌群丰度及多样性具有提高作用。郭慧等[10]研究发现，凡纳滨对虾饵料中加入水解单宁可提高放线菌门和拟杆菌门比例，降低变形菌门和厚壁菌门比例。本试验中，随栗木单宁添加浓度增加，变形菌门的比例降低，拟杆菌门的比例上升。不同研究结果表明，单宁对肠道菌群的影响受到试验条件的影响，单宁酸在水产动物上的利用及效果评价值有待进一步研究。4结论本研究表明，当日粮中添加300、600、900 mg/kg栗木单宁对凡纳滨对虾的生长性能和消化酶活无显著影响，可降低肠道菌群的变形菌门比例，对血清免疫及抗氧化指标存在负面作用。