丁酸梭菌（Clostridium butyricum）又名酪酸梭菌，属于芽孢杆菌科、梭菌属，是1种厌氧革兰氏阳性细菌[1]，能够产生乙酸和丁酸，主要存在于人和动物的消化道、土壤以及大曲和酒窖泥中[2]。吴杰等[3]研究表明，丁酸梭菌能够产生多种消化酶、维生素（维生素B1、B2、泛酸和烟酸等）和短链脂肪酸等营养物质，具有较好的肠道营养功能。李海花等[4]研究表明，丁酸梭菌在促进动物生长、调节肠道菌群平衡、抗肠道炎症和提高机体免疫力等方面发挥积极作用。本试验以在河南省鄢陵县农户生猪养殖场取得的新鲜猪粪便作为样品，筛选分离丁酸梭菌。并对菌株的生理生化特性和有机酸发酵特性进行初步分析，为后续丁酸梭菌的高密度培养和固态培养发酵奠定基础。1材料与方法1.1试验样品采集新鲜的生猪粪便，在无菌条件下取少量样品，加入无菌取样袋中带回实验室，-20 ℃冰箱保藏。1.2仪器与设备1260 Infinity高效液相色谱仪购自美国安捷伦科技公司；TM3030 plus 扫描电子显微镜购自日本日立高新公司；BL-100A高压蒸汽灭菌锅购自上海博讯实业有限公司；HCB-900V超净工作台购自青岛海尔生物医疗股份有限公司；PRACTUM 124-1CN分析天平购自德国赛多利斯公司；DW-86L578超低温冰箱购自青岛海尔生物医疗股份有限公司；DK-S24恒温水浴锅购自上海精宏实验设备有限公司；DNP-9162恒温培养箱购自上海精宏实验设备有限公司；DKY-Ⅱ恒温摇床购自上海杜科自动化设备有限公司；DELTA 320 pH计购自梅特勒-托利多国际有限公司。1.3培养基和试剂强化梭菌培养基（RCM）[5]：蛋白胨10 g、牛肉粉10 g、酵母粉3 g、葡萄糖5 g、可溶性淀粉1 g、氯化钠5 g、醋酸钠3 g、L-半胱氨酸盐酸盐0.5 g、琼脂0.5 g，调节pH值为6.8±0.1，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min，冷却，备用。梭菌选择性琼脂培养基（TSN琼脂[6]）：酵母浸膏10 g、胰蛋白胨15 g、柠檬酸铁0.5 g、亚硫酸钠1 g、琼脂13.5 g、蒸馏水1 000 mL，调节pH值为7.0±0.1，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min，冷却至50~60 ℃，每100 mL培养基中加入100 μg硫酸新霉素和4 μg多黏菌素B。丁酸梭菌生长培养基[7]：酵母浸粉30 g、葡萄糖10 g、NaCl 2 g、MgSO4·7H2O 0.25 g、K2HPO4 2 g、L-半胱氨酸盐酸盐0.5 g、蒸馏水1 000 mL，调节pH值为7.0±0.1，115 ℃高压蒸汽灭菌30 min，冷却，备用。1.4丁酸梭菌的分离和纯化取1 g样品于10 mL生理盐水中，振荡摇匀，置于80 ℃水浴10 min，杀死非芽孢微生物[8]。将水浴后的样品悬液以5%的接种量接种RCM液体培养基，37 ℃培养48 h。将上述培养好的菌液使用无菌的磷酸氯化钠缓冲液进行梯度稀释，各梯度稀释液取5 mL加入50 mL 45 ℃保温的TSN琼脂培养基中，混匀，倒入培养皿。将凝固好的TSN平板放入自封袋中，密封前放入厌氧产气包以保证无氧环境，将装有平板的自封袋37 ℃培养48 h，从平板中挑取黑色单菌落进行鉴定。1.5生理生化分析参照《伯杰氏细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》中的方法测定菌株的生理生化特征[9-10]。测定指标包括碳源利用、硝酸盐还原、淀粉水解、明胶液化、石蕊牛乳、接触酶和运动性试验。1.6分子生物学鉴定依照所购买的DNA提取试剂盒的说明书提取各菌株的DNA。采用细菌16s rDNA通用引物Primer1-27f（5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）和Primer2-1492R（5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'）对提取的DNA中16s rDNA序列进行扩增。PCR反应体系中各物质的添加量为：Taq酶0.2 μL、DNA 1 μL、Primer1 3 μL、Primer2 3 μL、dNTP 2 μL、Buffer 3 μL、H2O 17.8 μL。PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃延伸10 min。取3 μL PCR产物于1%琼脂糖凝胶中进行电泳，验证产物分子量的大小。将扩增得到的16S rNDA序列送至北京六合华大基因科技有限公司武汉分公司测序。将测序得到的16s rDNA序列在NCBI数据库中通过Blast工具进行比对，查找最相似序列。使用MEGA-X软件将筛得菌株的16S rDNA与相关序列通过ClustalW进行多序列比对，并用邻接法（neighbor-joining method）通过1 000次bootstrap进行验证，建立系统发育树[10]。1.7丁酸梭菌的发酵特性及测定1.7.1丁酸梭菌的发酵特性将已在丁酸梭菌生长培养基中培养24 h的种子液以5%的接种量接种新的丁酸梭菌生长培养基（3组平行），37 ℃培养，0 h取样，之后每12 h取样1次，测定发酵液的pH值和菌浓度以及还原糖、乙酸和丁酸的含量，确定其发酵曲线。还原糖采用二硝基水杨酸（DNS）法测定。乙酸和丁酸的含量采用高效液相色谱（HPLC）法测定，具体测定步骤如下：采用Agilent HPLC 1260 Infinity高效液相色谱系统对丁酸梭菌发酵液中的乙酸和丁酸浓度进行测定。配备TSKgel ODS-100V（5 μm，4.6 mm×250 mm，TOSOH）色谱柱，柱温为40 °C。流动相分为甲醇（A）和0.1%磷酸（B），流速1.0 mL/min。进样量为10 μL，洗脱方式为：1~4 min为100%B，4~5 min内A从0%上升到20%，5~12 min保持20% A+80% B，12~13 min内A升至100%，保持2 min，在15~16 min流动相A降至0%。UV检测器波长设置为220 nm，乙酸和丁酸的保留时间分别为6.05 min和15.60 min。分别单独配制0.1~8 g/L冰乙酸（≥99.5%）和正丁酸（≥99.5%）作为标准曲线。每个样品重复2次进样，结果取平均值。2结果与分析2.1菌株形态学观察在TSN琼脂培养基中，硫酸新霉素和多黏菌素B均能够抑制肠杆菌科细菌的生长，硫酸新霉素能抑制双酶梭菌（Paraclostridium bifermentans）的生长，而不抑制丁酸梭菌的生长。TSN琼脂培养基中生长的菌落见图1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.017.F001图1TSN琼脂培养基中生长的菌落由图1可知，细菌生长时能够将亚硫酸盐还原为硫化物，与柠檬酸铁反应生成黑色的硫化铁环绕在菌落周围。经过对在TSN培养基中筛选得到的菌落的分离纯化，得到2株形态符合丁酸梭菌特征的菌株，分别命名为B1、B3。在扫描电子显微镜下，放大6 000倍观察丁酸梭菌B1和B3，其形态见图2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.017.F002图2丁酸梭菌在扫描电子显微镜下的形态（6 000×）（a） 丁酸梭菌B1 （b） 丁酸梭菌B3由图2可知，菌体呈梭杆状，端圆、直或弯曲，符合丁酸梭菌形态特征。2.2菌株生理生化鉴定结果B1和B3菌株的生理生化鉴定见表1。由表1可知，B1、B3菌株有相同的生理生化特征，均能够利用葡萄糖、果糖、麦芽糖等糖类作为碳源，均能够水解淀粉，但是均不能利用松三糖、鼠李糖和山梨醇。研究表明，B1、B3菌株能够生产胞外淀粉酶，不能水解明胶，但均能够发酵牛乳使其产酸、凝固。在半固体培养基穿刺试验中，两者均显示出运动性；而在过氧化氢酶试验中，两者均为阴性，且不能还原硫酸盐。以上这些生理生化特征均与丁酸梭菌的特征相符。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.017.T001表1B1和B3菌株的生理生化鉴定结果项目B1B3项目B1B3葡萄糖++棉籽糖++果糖++山梨醇--阿拉伯糖++甘露醇+-+-蔗糖++肌醇+-+-乳糖++糖原++半乳糖++水杨苷++麦芽糖++石蕊牛乳凝固、胨化凝固、胨化木糖++明胶液化--纤维二糖++淀粉水解++密二糖++硝酸盐还原--松三糖--运动性++海藻糖++过氧化氢酶--鼠李糖--注：“+”表示试验结果为可利用或阳性，“-”表示不可利用或阴性，“+-”表示疑似阳性。2.3菌株分子生物学鉴定结果B1和B3菌株16S rDNA片段PCR扩增产物的电泳条带见图3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.017.F003图3B1和B3菌株16S rDNA片段PCR扩增产物的电泳条带由图3可知，对分离菌株的16S rDNA序列进行PCR扩增，再经过1%琼脂糖凝胶电泳，获得1 000~2 000 bp之间的特异性条带。送至北京六合华大基因科技有限公司武汉分公司测序，得到B1和B3菌株的16S rDNA序列。根据同源关系远近，将B1、B3以及丁酸梭菌JCM 1 391等标准模式菌株的16S rDNA序列经MEGA-X软件ClustalW算法比对后通过邻接法构建系统发育树。菌株B1和B3的系统发育树见图4。由图4可知，B1和B3与丁酸梭菌在同源性上最相关。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.017.F004图4菌株B1和B3的系统发育树2.4菌株的发酵特性B1和B3的发酵曲线见图5。由图5可知，B1和B3在12 h后达到对数生长期末进入稳定期。在稳定期中B1的菌浓度低于B3；pH值大致相当。B3发酵液的残糖（还原糖）含量更低，说明在对葡萄糖的利用上，B3明显更具优势。无论在对数生长期还是在稳定期，B3菌株的菌浓度（OD600 nm）明显高于B1。因此，B3作为微生态制剂在生产实践上更具优势。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.017.F005图5B1和B3在生长培养基中的菌浓度（OD600 nm）、pH值和还原糖浓度随时间变化曲线B1和B3发酵液中乙酸和丁酸浓度随培养时间的变化曲线见图6。图6B1和B3发酵液中乙酸和丁酸产量随培养时间的变化曲线10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.017.F6a1（a）乙酸产量随培养时间的变化曲线10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.017.F6a2（b）丁酸产量随培养时间的变化曲线由图6可知，乙酸的产生贯穿丁酸梭菌的对数生长期和稳定期，而丁酸的代谢与丁酸梭菌的对数生长期高度重合。在乙酸产量上，B1和B3菌株的发酵液有较大差别，B3菌株的乙酸产量明显高于B1菌株；而在丁酸产量上，B1和B3菌株的产量无明显区别。3讨论肠道微生物在家畜生长发育、营养代谢和健康免疫等方面具有重要的作用[11]。正常定植的细菌被称为共生菌。共生菌与肠道以及共生菌与共生菌之间的相互作用形成复杂的生态系统。在健康的动物肠道中，这一生态系统达能够到稳态。机体内外环境的变化可能会引起肠道菌群失衡，造成外来致病菌和条件致病菌的生长，将会对宿主的健康造成威胁[12]。粪菌移植（fecal microbiota transplantation, FMT）通过将健康动物的粪便菌群移植到肠道菌群失调的动物胃肠道内，重建其肠道菌群以恢复稳态，从而达到治疗肠道疾病的目的[13]。基于此原理，大量微生态制剂被开发和应用，如屎肠球菌[14]、粪肠球菌[15]、枯草芽孢杆菌[16]等。丁酸梭菌存在于家畜的消化道中，是畜类肠道微生态菌群的重要组成菌株之一。丁酸梭菌在动物肠道内产生的乙酸、丁酸等短链脂肪酸能够被肠道细胞直接利用，是肠道动力的直接来源。丁酸梭菌能够促进双歧杆菌和乳杆菌等肠道益生菌的增殖，抑制葡萄球菌、大肠杆菌和产气荚膜梭菌等致病菌的生长，从而促进肠道生态平衡，提高动物肠道的消化和吸收能力，增强动物的免疫力[2]。4结论本研究以河南省鄢陵县农户肉猪养殖场新鲜猪粪作为材料，经选择性培养基筛选分离、生理生化鉴定和16S rDNA鉴定得到2株丁酸梭菌B1和B3。研究发现，B3在发酵液中的菌浓度和对碳源的利用率强于B1菌株，乙酸产量高于B1菌株，作为肠道微生态制剂比B1更具优势。