工业生产的原材料或终产品为日常生活提供许多便利，但也不可避免地产生了一些环境污染问题。六氟双酚A（BPAF）主要应用于制常见的塑料制品造聚碳酸酯塑料和环氧树脂，如食品包装、玩具、牙科材料、耐热耐高温的工业材料[1-2]。BPAF具有雌激素样活性，作为一种环境中的内分泌干扰物质（EEDs），已被证明能够引发动物以及人类的生殖发育毒性[3-4]。Caroline等[5]研究表明，BPAF可引起斑马鱼的雌激素样毒性，但其毒性机制尚无进一步深入探讨。因此，本研究以斑马鱼的肝脏细胞作为研究模型，探讨BPAF对斑马鱼的毒性机制，进一步为BPAF的研究提供参考。1材料与方法1.1试剂与仪器主要试剂：六氟双酚A购自美国sigma公司；CCK-8试剂购自日本同仁化学研究所；丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒，均购自中国南京建成生物工程研究所；逆转录试剂盒以及荧光定量试剂盒购自TaKaRa公司；胎牛血清及DMEM/F12培养基购自Gibico公司。主要仪器：二氧化碳细胞培养箱、微孔板酶标仪（Thermo fisher）；高速冷冻离心机（Eppendorf）；7500Fast实时荧光定量仪（ABI公司）。1.2试验材料斑马鱼肝脏细胞系ZFL细胞（ATCC）购自国家斑马鱼资源中心。1.3测定指标及方法1.3.1ZFL细胞毒性试验取对数增长期的ZFL细胞，消化后按照8×103个/孔的ZFL细胞接种在96孔板中，以每孔100 μL的含10%胎牛血清DMEM/F12培养基进行培养。28 ℃、5% CO2条件下培养约12~24 h，待细胞生长至对数生长期，设置不同浓度的BPAF浓度（0、1、5、10、20、30、40、50 μmol/L），以0浓度组为对照组；每孔重复6次，24 h后按照空白培养基∶CCK-8试剂为10∶1的比例加入CCK-8，28 ℃、5% CO2培养约3~4 h，450 nm波长检测各组OD值。细胞存活率=（试验孔OD450 nm值-空白孔OD450 nm值）/（对照孔OD450 nm值-空白孔OD450 nm值）×100%（1）1.3.2ZFL细胞的氧化应激水平将ZFL细胞接种在100 mm的培养皿中，待细胞生长至对数增长期，设置不同的BPAF浓度（0、10、20、30 μmol/L），以0浓度组为对照组；每组设置3个重复，处理24 h，胰酶收集各组细胞，通过超声仪破碎裂解细胞，于4 ℃冰上检测细胞的CAT、SOD、GSH-Px活性以及MDA含量，并检测细胞内的蛋白浓度。CAT、SOD、GSH-Px活性以及MDA含量的检测方法按照试剂盒说明书进行。1.4数据统计与分析数据采用SPSS 22.0软件进行t检验及单因素方差（ANOVA）分析。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1BPAF对ZFL细胞活性的影响（见图1）由图1可知，与对照组相比，10、20、30、40、50 μmol/L BPAF组细胞活性极显著下降（P0.01），且呈BPAF依赖性的浓度下降趋势。当BPAF的浓度为40 μmol/L时，ZFL细胞活性下降了55.51%，接近半数致死量。因此，以下试验选择0、10、20、30 μmol/L作为BPAF的研究浓度。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.01.004.F001图1BPAF对ZFL细胞活性的影响Fig.1Effect of BPAF on ZFL cell viability注 ： 与对照组相比，*表示差异显著（P0.05），**表示差异极显著（P0.01）；下图同。2.2BPAF对ZFL细胞的MDA含量、GSH-Px活性的影响（见图2）由图2（a）可知，与对照组相比，10 μmol/L BPAF组细胞MDA含量显著提高（P0.05），20、30 μmol/L BPAF组细胞MDA含量极显著提高（P0.01）。由图2（b）可知，与对照组相比，20、30 μmol/L BPAF组GSH-Px活性极显著降低（P0.01）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.01.004.F002图2BPAF对ZFL细胞的MDA含量、GSH-Px活性的影响Fig.2Effect of BPAF on the content of MDA and activity of GSH-Px in ZFL cells2.3BPAF对ZFL细胞CAT、SOD活性的影响（见图3）由图3（a）可知，与对照组相比，10、20、30 μmol/L BPAF组细胞CAT活性均极显著降低（P0.01）。由图3（b）可知，20、30 μmol/L BPAF组细胞SOD活性极显著降低（P0.01）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.01.004.F003图3BPAF对ZFL细胞CAT、SOD活性的影响Fig.3Effect of BPAF on the activities of CAT and SOD in ZFL cells3讨论双酚类化合物作为日常生活中经常接触的工业化合物，主要应用于合成环氧树脂以及聚碳酸酯等分子材料，已被证明是一类对人类及动物健康有影响的内分泌干扰物[6]。BPAF作为BPA中的新兴高分子材料，广泛应用于日常塑料制品中[7]。研究表明，BPAF可造成哺乳动物的生殖毒性以及肝毒性[1]。氧化应激指细胞内的氧化水平及抗氧化水平失去平衡。Lei等[8]研究发现，BPAF可引起乳腺癌细胞MCF-7的活性氧水平上升，造成细胞内的氧化应激。MDA是脂质过氧化物[9]，CAT和SOD是细胞内的一类抗氧化酶[10]，均可作为细胞内的抗氧化水平的标志物。GSH-Px作为细胞中合成的最丰富的低分子量硫醇化合物，可通过清除自由基保护细胞免受氧化损伤[11]。本试验中选择了具有显著毒性作用的BPAF作为ZFL细胞的研究浓度，以MDA含量和GSH-Px活性分析ZFL细胞内的氧化应激水平，可知BPAF引起了ZFL细胞内的氧化应激。通过CAT及SOD分析细胞内的抗氧化水平，发现ZFL细胞中的抗氧化水平下降，标志着氧化应激及抗氧化水平下降情况下，BPAF导致了ZFL细胞内的氧化损伤。4结论本研究结果表明，BPAF可通过促使斑马鱼肝脏细胞的MDA含量上升，GSH-Px、CAT、SOD活性下降，导致ZFL发生氧化损伤，导致细胞产生细胞毒性。