壬基酚(NP)和壬基酚聚氧乙烯醚(NPEO)是一类非离子表面活性剂，具有良好的润湿、分散、增溶乳化的作用，被广泛用于日用化学品和纺织品中[1]。NP和NPEO通常也作为抗氧化剂加入塑料制品，以增强塑料的稳定性和韧性[2-3]。但NP已被认定为环境内分泌干扰物，可以对人体生殖系统产生干扰的外援雌激素，会对内分泌系统和生殖系统造成影响，使垂体、卵巢、睾丸等部位的功能出现异常[4]。而NPEO虽然毒性较低，但其进入环境会发生降解，降解的主要产物是毒性较强的NP。过去几十年，NP和NPEO的大量使用，在大气、土壤、河流、海洋、沉积物、水生生物体中均发现NP[5]，在肉类、水产类、粮食、蔬菜、奶粉、食用油等食物中也检出NP[6]。因此NP和NPEO的污染问题已引起人们的关注。2001年，NP被确定为欧盟水政策领域的优先危险物质。2003年欧盟颁布的2003/53/EC指令，要求其所有成员国从2005年开始，NP和NPEO在纺织品、塑料、皮革、橡胶等产品中的含量不得大于1 000 mg/kg[7]。目前对NP和NPEO检测主要集中于环境样品、纺织品、皮革、食品及食品包装材料等方面[8]，对于鞋材塑料的研究较少。而鞋类是消费量较大的快销类日用品，废弃的鞋材不能够有效回收利用，将带来环境污染问题。同时NP和NPEO也会进入环境，最终影响人类的健康。本实验拟建立塑料鞋材中NP和NPEO的检测方法，该方法能够适应大批量的样品检测，确保检测结果的准确可靠。1实验部分1.1主要原料甲醇，HPLC(≥99.9%)，上海麦克林生化科技有限公司；乙腈，HPLC(≥99.9%)，上海麦克林生化科技有限公司；二氯甲烷，分析纯，上海国药试剂有限公司；丙酮，分析纯，上海国药试剂有限公司；壬基酚聚氧乙烯醚(NPEO)，纯度≥99.7%，德国Dr. Ehrenstorfer GmbH；壬基酚(NP)，纯度≥99.9%，德国Dr. Ehrenstorfer GmbH；反相C18色谱柱，XDB-18，美国安捷伦科技有限公司；HLB固相萃取小柱，500 mg/6mL，杭州微米派科技有限公司；C18固相萃取小柱，500 mg/6mL，杭州微米派科技有限公司。1.2仪器与设备液相色谱质谱联用仪，1260-6460，美国安捷伦科技有限公司；索氏萃取器，ZSY-12，天津美特斯试验机厂；加速溶剂萃取仪，ASE350，赛默飞科技有限公司；研磨仪，F-VD300，弗卡斯仪器有限公司；隔膜真空泵，N86KN，浙江纳德科学仪器有限公司。1.3仪器条件1.3.1色谱条件色谱柱为C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，色谱柱温度40 ℃，进样量10 μL。流动相A为乙腈，流动相B为超纯水。梯度洗脱程序为：流动相A为70%，流动相B为30%，保持1 min；1 min后，流动相A比例开始增加，流动相B比例开始减少；至3 min时，流动相A为95%，流动相B为5%，保持至6 min；6 min后，流动相A比例开始减少，流动相B比例开始增加；至8 min时，流动相A为70%，流动相B为30%，直至10 min结束。流速1.0 mL/min；色谱柱温度35 ℃；进样量10 μL。1.3.2质谱条件电离源：电喷雾离子源(ESI)；毛细管电压：4.5 kV；干燥气体流速：15 L/min；干燥气体温度：400 ℃；监测模式：全扫描&选择离子检测模式同时进行；NP选择监测离子m/z：219；NPEO选择监测离子m/z：595.6、639.6。1.4标准溶液配制将NP标准品和NPEO标准品，采用甲醇溶液分别配制质量浓度为10 mg/mL的单标储备液。分别取适量的NP和NPEO标准储备液进行混合，利用甲醇定容，配制质量浓度为1 mg/mL的混合标准储备液。储备液均密封，置于4 ℃下冷藏，待使用时根据需要稀释。1.5样品处理1.5.1样品制备将拆分得到的鞋材塑料部件，放入液氮中冷冻过夜。利用研磨机粉碎至粒径小于2 mm的细小颗粒，混合均匀后密封保存，待用。1.5.2样品提取准确称取0.5 g塑料鞋材样品，加入20 mL二氯甲烷与丙酮（体积比为4∶6）混合溶液，80 ℃、10.3 MPa压力下，进行加速溶剂萃取，静态萃取7 min，萃取2次。1.5.3样品净化先对HLB固相萃取小柱进行预淋洗，预淋洗溶液顺序5 mL纯水→5 mL乙腈溶液→5 mL二氯甲烷∶丙酮(4∶6)混合溶液。量取样品萃取液5 mL过HLB固相萃取小柱，采用15 mL乙腈溶液进行洗脱，洗脱液流速≤1 mL/min。将洗脱液利用氮气吹扫浓缩至近干，再定容至1 mL，待液相色谱质谱联用仪检测。1.5.4液相色谱质谱联用仪的测定将得到的1 mL乙腈溶液，按照1.3的仪器条件进行检测。实际样品检测中样品顺序为：标准溶液→样品流程空白溶液→实际样品（10个）→标准溶液→实际样品。图1为样品标准色谱图。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2021.11.022.F001图1NP和NPEO的标准色谱图Fig.1Standard chromatograms of NP and NPEO2结果与讨论2.1样品提取2.1.1提取方式及提取溶剂的选择目前对于NP和NPEO的提取主要采用的提取方式是索氏提取，提取的溶剂是甲醇。但索氏提取法不仅耗时长，而且同一批次处理的样品数量少，导致实际样品的检测效率偏低。因此对比分析索氏提取和加速溶剂萃取法。鞋材所用塑料特别是鞋底的塑料，成分较复杂，常用的甲醇提取液不一定适合，除甲醇溶液外，还探究二氯甲烷、乙酸乙酯、二氯甲烷∶丙酮(4∶6)和甲醇∶乙酸乙酯(4∶6)等4种溶液的提取效率。图2为2种提取方式、5种提取溶剂对NP和NPEO的提取效率。图2NP和NPEO不同提取方式和提取溶剂的回收率Fig.2Recovery of NP and NPEO by different extraction methods and extraction solvents10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2021.11.022.F2a1（a）NP10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2021.11.022.F2a2（b）NPEO从图2a可以看出，2种萃取方式是二氯甲烷∶丙酮(4∶6)混合溶液的提取效率最高，提取效率最低的是乙酸乙酯溶液。从图2b可以看出，2种萃取方式提取效率最高的是二氯甲烷∶丙酮(4∶6)混合溶液，最低的是乙酸乙酯溶液，甲醇∶乙酸乙酯(4∶6)和甲醇、二氯甲烷的提取效率接近。因为NP和NEPO易溶于丙酮，而二氯甲烷的对于鞋材塑料的渗透性最好，二者的混合溶液取得最佳的提取效果。采用二氯甲烷∶丙酮(4∶6)混合溶液为提取剂时，加速溶剂萃取的提取效率与索氏提取法接近，因此可以采用效率更高、样品通量更大的加速溶剂萃取法萃取鞋材塑料中NP和NPEO。2.1.2加速溶剂萃取温度的优化采用甲醇为溶剂、索氏提取法提取NP和NPEO时，一般回流温度设定80 ℃，高于甲醇64.8 ℃沸点温度。考虑二氯甲烷沸点39.75 ℃、丙酮沸点56.53 ℃，设定加速溶剂萃取法的温度为55、60、65、70、75、80、85 ℃。图3为加速溶剂萃取温度对NP和NPEO萃取效率的影响。从图3可以看出，当温度为70 ℃，NP、NPEO的回收率达到80%；当温度大于80 ℃，NP、NPEO的回收率接近100%；当温度继续升高，回收率随温度的增加无明显变化。因此设定加速溶剂萃取温度为80 ℃。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2021.11.022.F003图3加速溶剂萃取温度对NP和NPEO萃取效率的影响Fig.3Effect of accelerated solvent extraction temperature on extraction efficiency of NP and NPEO2.1.3加速溶剂萃取静态萃取时间的优化选择4~10 min加速溶剂萃取静态萃取时间的优化。图4为萃取回收率随静态萃取时间变化的曲线。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2021.11.022.F004图4NP和NPEO回收率随静态萃取时间的变化Fig.4Changes of NP and NPEO recoveries with static extraction time从图4可以看出，当静态萃取时间为4 min，NP、NPEO的回收率为70%左右。静态萃取时间增至7 min时，NP、NPEO回收率接近100%。因此7 min的静态萃取时间已满足检测需求。2.2样品净化2.2.1固相萃取小柱的选择因为鞋材中的塑料主要来自鞋底，成分较为复杂，加速溶剂萃取后的提取液需要采用固相萃取小柱进行净化，以减少样品基质对仪器检测的干扰。分别探究填料量均为500 mg的HLB固相萃取小柱和C18固相萃取小柱，对NP和NPEO进行固相萃取的效率，图5为测试结果。从图5可以看出，HLB小柱对NP和NPEO的回收率均大于95%，而C18小柱对于NP的回收率在70%左右，对NPEO的回收率在75%左右。显然HLB小柱更适合应用于NP、NPEO的固相萃取。NP、NPEO具有相似的结构，即苯环上具有非极性的脂肪酸碳链和极性的—OH官能团。而C18小柱对于非极性的脂肪酸碳链具有较好的吸附作用，对于极性的—OH官能团吸附能力较差；HLB小柱却对极性和非极性端都具有较好的吸附作用，所以对NP、NPEO均有较好的萃取效率。因此选择500 mg的HLB小柱进行固相萃取净化。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2021.11.022.F005图5两种固相萃取小柱对NP、NPEO萃取效率的比较Fig.5Comparison of extraction efficiency of two solid phase extraction columns for NP and NPEO2.2.2洗脱溶液的选择固相萃取洗脱液既需要与液相色谱流动相乙腈、水具有较好互溶性，又能够对NP、NPEO具有较好洗脱能力。因此洗脱溶液为甲醇、丙酮和乙腈，图6为不同洗脱液对NP、NPEO的洗脱效率实验结果。从图6可以看出，3种洗脱溶液中，丙酮溶液洗脱得到的回收率最低，甲醇和乙腈对NP、NPEO的回收率均大于97%。流动相中含有乙腈，因此选定的洗脱溶液为乙腈。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2021.11.022.F006图6不同洗脱液对NP、NPEO的洗脱效率Fig.6Elution efficiency of NP and NPEO with different eluents2.2.3洗脱液体积的优化洗脱溶液的体积对回收率具有较大影响，选择5、10、15、20、25 mL体积的乙腈进行考察，图7为检测得到NP、NPEO的回收率随洗脱液体积增加的变化的结果。从图7可以看出，当洗脱液体积为5 mL，NP、NPEO的回收率均低于70%；当洗脱液体积为15 mL，NP、NPEO的回收率接近100%；随着洗脱液体积继续增加，回收率无明显变化。因此选择15 mL乙腈洗脱液。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2021.11.022.F007图7NP、NPEO的回收率随着洗脱液体积增加的变化Fig.7The recoveries of NP and NPEO changed with the increasing of eluent volume2.3方法线性范围将1 mg/L的NP、NPEO混合标准储备液稀释得到0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 mg/L等系列标准溶液。将NP、NPEO的色谱峰面积与对应的标准溶液质量浓度进行线性拟合，得到二者的线性范围和相关系数，图8为拟合结果。从图8可以看出，NP的线性相关系数为0.999 6，NPEO的线性相关系数为0.999 2，NP和NPEO在0.5~20.0 mg/L质量浓度范围内具有良好的线性相关性。图8NP、NPEO的标准曲线图Fig.8Standard curve of NP and NPEO10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2021.11.022.F8a1（a）NP10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2021.11.022.F8a2（b）NPEO2.4检出限、回收率及精密度根据仪器检测得到的3倍信噪比(S/N)计算出目标物的检出限。称取阴性塑料鞋底样品，加入NP、NPEO标准溶液，得到浓度为5、20、100 mg/kg的样品，根据实测值和理论值的比值计算对应的回收率。对每个浓度样品平行检测6次，计算RSD得到方法的精密度。表1为NP及NPEO的检出限、回收率、精密度结果。从表1可以看出，NP的回收率为97.5%~103.1%，精密度为小于6%，NPEO的回收率为97.6%~98.9%，精密度小于7%，说明可以得到准确可靠的NP、NPEO检测结果。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2021.11.022.T001表1NP及NPEO的检出限、回收率及精密度Tab.1Detection limit， recovery and precision of NP and NPEO样品样品浓度/（mg·kg-1）检出限/（mg·kg-1）回收率/%精密度/%NP50.011103.15.22099.64.610097.53.3NPEO50.01897.66.82098.36.310098.94.12.5样品测定选取5款皮鞋的塑料鞋底、5款凉鞋的塑料鞋底，5款休闲运动鞋的塑料鞋底以及这5款运动鞋面上塑料部件，共计20份塑料鞋材样品进行检测，表2为检测结果，图9为其中样品SS-4和SV-1的色谱图。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2021.11.022.T002表2样品检测结果Tab.2Sample test results序号样品编号NPNPEO1LS-1n.d.n.d.2LS-2n.d.n.d.3LS-3n.d.n.d.4LS-4n.d.n.d.5LS-5n.d.n.d.6SS-1n.d.n.d.7SS-2n.d.n.d.8SS-3n.d.n.d.9SS-4n.d.45.710SS-5n.d.n.d.11SN-1n.d.n.d.12SN-2n.d.n.d.13SN-3n.d.n.d.14SN-4n.d.n.d.15SN-5n.d.n.d.16SV-156.8103.417SV-2n.d.n.d.18SV-378.055.619SV-4n.d.33.920SV-553.275.6注：“LS”代表皮鞋鞋底；“SS”代表凉鞋鞋底；“SN”代表运动鞋鞋面上的塑料部件；“SV”代表运动鞋鞋底；“n.d.”代表未检出。mg·kg-1mg·kg-1图9样品SS-4和SV-1色谱图Fig.9Chromatogram of sample SS-4 and SV-110.15925/j.cnki.issn1005-3360.2021.11.022.F9a1（a）SS-410.15925/j.cnki.issn1005-3360.2021.11.022.F9a2（b）SV-1从表2可以看出，4类样品中，其中3个样品检出NP，检出率为15%；5个样品检出NPEO，检出率为25%。NP的浓度范围为53.2(SV-5)~78.0 mg/kg(SV-3)，检出的NPEO浓度范围为33.9(SV-4)~103.4 mg/kg(SV-1)。其中，皮鞋鞋底塑料样品和运动鞋鞋面上塑料样品，没有检出NP和NPEO。5个凉鞋鞋底塑料样品中仅有1个样品检出NPEO，浓度为45.7 mg/kg，NP未检出。检出率最高的是运动鞋底塑料样品，5个样品中有4个样品检出NPEO，3个样品检出NP，且检出NP和NPEO浓度最高。3结论通过优化样品提取方法和固相萃取条件，建立塑料鞋材中NP和NPEO的检测方法。该方法中NP和NPEO在0.5~20.0 mg/L范围内有良好的线性相关性(R20.999 0)，NP的检出限为0.011 mg/kg，NPEO检出限为0.018 mg/kg。NP在5~100 mg/kg的浓度范围内回收率为97.5%~103.1%，精密度为3.3%~5.2%；NPEO的回收率为97.6%~98.9%，精密度为4.1%~6.8%。该检测方法的样品提取效率高、检测线性范围广、准确、重复性好，可满足塑料鞋材样品中NP和NPEO的检测需求。