重组禽流感病毒（H5+H7）三价灭活疫苗（H5N1 Re-11株+Re-12株、H7N9 H7-Re3株）可预防由H5亚型2.3.4.4d分支、2.3.2.1d分支和H7亚型禽流感病毒引起的禽流感[1-3]，多应用于雏鸡和成鸡的免疫，具有免疫效果好、安全性高的特点，广泛应用于鸡养殖生产[4-6]。免疫佐剂是一种能够强化疫苗抗体生成的物质[7]。免疫佐剂与疫苗同时使用可以提高疫苗的免疫应答率[8]。在实际疫苗免疫中，因为动物个体差异造成动物免疫效果不理想，重复接种工作烦琐，成本较高[9]。为一次性获得免疫应答效果，研究人员不断研究增加疫苗免疫应答率的方法。其中使用免疫佐剂是目前最有效的实现疫苗免疫增强的方式[10-12]。本试验采用不同抗原含量配比并添加免疫佐剂，通过效力检验了解免疫佐剂对禽流感抗体产生的影响。1材料与方法1.1试验动物28日龄SPF鸡由辽宁益康生物股份有限公司提供。1.2试验材料禽流感H5N1 Re-11株灭活抗原、H5N1 Re-12株灭活抗原、H7N9 H7-Re3株灭活抗原，均由辽宁益康生物股份有限公司制备检验。白油（大连百润祥经贸有限公司，批号688826）、吐温（CRODA公司，批号46389）、司本（CRODA公司，批号45278）。免疫佐剂（Ⅱ）由辽宁益康生物股份有限公司制备，检验。1.3试剂与仪器禽流感病毒H5亚型阳性血清（Re-11株）、禽流感病毒H5亚型阳性血清（Re-12株）、禽流感病毒H7亚型阳性血清（H7-Re3株）、禽流感病毒H5亚型血凝抑制试验抗原（Re-11株）、禽流感病毒H5亚型血凝抑制试验抗原（Re-12株）和禽流感病毒H7亚型血凝抑制试验抗原（H7-Re3株），均由辽宁益康生物股份有限公司提供。T25高速剪切机（IKA公司）、BSC-1304IIA2生物安全柜（北京东联哈尔仪器制造有限公司）、3k15高速冷冻离心机（Sigma公司）。1.4试验设计取95份注射白油加热，加入5份司本-80，混匀，高压灭菌。94份含定量免疫佐剂（Ⅱ）的抗原加入6份灭菌吐温-80，充分振荡使吐温-80完全溶解。乳化罐中加入3份油相与2份水相，充分搅拌乳化，2~8 ℃保存。将禽流感的3种抗原按不同抗原含量添加免疫佐剂（Ⅱ）配苗乳化，分别为：A组抗原含量为30%，不添加免疫佐剂，设为对照组；B组抗原含量为30%，添加免疫佐剂（Ⅱ）；C组抗原含量为25%，添加免疫佐剂（Ⅱ）；D组抗原含量为20%，添加免疫佐剂（Ⅱ）；E组抗原含量为15%，添加免疫佐剂（Ⅱ）；F组为不免疫对照组。按乳化试验方法进行成品疫苗的配制，各分组分别制备300 mL成品疫苗。成品疫苗配制方案见表1。对28日龄SPF鸡进行疫苗免疫，剂量为0.3 mL/只。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.12.016.T001表1成品疫苗配制方案Tab.1Finished vaccine formulation program组别品种批号抗原含量/%增效剂添加量/(mg/羽)成品配制量/mLA组H5 Re-11株202120300300H5 Re-12株20211730H7 Re-3株20211830B组H5 Re-11株202120301.2300H5 Re-12株20211730H7 Re-3株20211830C组H5 Re-11株202120251.2300H5 Re-12株20211725H7 Re-3株20211825D组H5 Re-11株202120201.2300H5 Re-12株20211720H7 Re-3株20211820E组H5 Re-11株202120151.2300H5 Re-12株20211715H7 Re-3株202118151.5测定指标及方法分别于免疫后7、14、21 d对鸡静脉采血，37 ℃孵育1 h，6 000 r/min离心3 min，分离血清，-20 ℃保存。采用HI方法测定禽流感H5亚型Re-11株和Re-12株、禽流感H7亚型H7 Re-3株HI抗体效价，标定抗原为4单位抗原。2结果与分析2.1HI抗体平均值（见表2）由表2可知，作为不免疫对照组的F组，抗体效价至21 d仍小于1.0，表明免疫成功。免后7、14 d，B组H5亚型和H7亚型HI抗体均高于其他试验组；免后21 d，D、E组HI抗体效价效果较好，均不低于B、C组。结果表明，免疫佐剂对抗体提升具有一定效果。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.12.016.T002表2HI抗体平均值（1∶X）Tab.2Average value of HI antibody (1∶X)组别免前免后7 d免后14 d免后21 dRe-11Re-12Re-3Re-11Re-12Re-3Re-11Re-12Re-3Re-11Re-12Re-3A组1.01.01.03.24.44.08.06.66.89.09.18.0B组1.01.01.05.06.25.29.48.08.610.710.79.3C组1.01.01.03.44.45.08.48.48.210.510.69.0D组1.01.01.04.25.45.08.08.28.210.810.89.2E组1.01.01.03.44.84.68.47.68.010.910.88.9F组1.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.02.2H5亚型（Re-11株）HI不同组抗体变化检测结果（见表2）由表2可知，免后7、14 d，B组的禽流感H5亚型Re-11株的HI抗体结果高于其他组；免后21 d，与A组相比，B组、C组、D组和E组HI抗体效价均高约1.5~1.9个滴度。2.3H5亚型（Re-12株）HI不同组抗体检测测定结果（见表2）由表2可知，免后7 d，B组禽流感H5亚型Re-12株的HI抗体结果高于其他组；免后14 d，B组、C组和D组的HI抗体结果均略高于E组；免后21 d，与A组相比，B组、C组、D组和E组HI抗体效价均高约1.5~1.7个滴度。2.4H7亚型（Re3株）HI不同组抗体变化检测结果（见表2）由表2可知，免后7、14、21 d，B组、C组、D组和E组H7亚型Re-3株的HI抗体无显著差异；21 d结果显示，各组HI抗体值在8.9~9.3之间，较A组高约0.9~1.3个滴度。3讨论重组禽流感病毒灭活疫苗为强制免疫疫苗品种[13]，广泛应用于蛋鸡、肉鸡和水禽等免疫，通过疫苗的免疫产生较高的抗体，从而达到对高致病性禽流感的预防作用[14-15]。如何能够及时有效地产生和提升抗体，成为各企业和科研单位的公关方向。免疫佐剂是一类通过非特异性途径提高机体对抗原或微生物特异性反应的物质[16-17]。本试验通过应用相同含量抗原和不同含量抗原添加免疫佐剂制备禽流感疫苗进行效力检验，结果表明，30%抗原含量添加免疫佐剂组（B组）在免疫后7、14 d的HI抗体效价略高于抗原含量低或未添加免疫佐剂的组别；免后21 d，添加免疫佐剂的不同抗原含量各组间HI抗体效价差异不显著，并且较30%抗原含量不添加免疫佐剂组（A组）高约0.9~1.9个滴度。4结论试验结果表明，免疫佐剂能够提高鸡群对禽流感疫苗的免疫应答效果，降低抗原含量时还能够保证21日效力检验的即时效价。由于本试验依据禽流感效力检验方法进行抗体判定，所以对于免疫佐剂在降低抗原含量使用的情况下是否能够达到4个月的免疫持续期，并保证抗体效价在6Log2以上，仍需进一步监测跟踪。同时，还需对鸡群生产性能等指标进行监测，以验证免疫佐剂的安全性。