菜籽粕是菜油籽经压榨提油后的副产物，每年产量约700万t[1]。菜籽粕中粗蛋白含量高，含有丰富的维生素与微量元素[2]。但菜籽粕中含有较高浓度的硫代葡萄糖苷（硫苷）、单宁、植酸等抗营养因子，对饲用价值具有较强的负面作用。动物摄入过多的硫苷会导致内脏受损，严重影响生产性能，极大地制约菜籽粕在畜禽养殖中的应用[3]。目前对菜籽粕中硫苷等抗营养因子的处理方法包括机械破碎法、热处理法等，但效果并不理想，且会提高饲料生产成本，导致营养物质流失[4]。研究发现，微生物发酵可以高效处理菜籽粕中的抗营养因子，提高菜籽粕饲用价值，并且复合菌种发酵比单一菌种发酵更有优势[5]。利用复合菌剂对菜籽粕进行发酵处理是目前提高菜籽粕饲用价值的重要手段。因此，本研究使用混合菌剂对菜籽粕进行处理，通过单因素试验与正交试验以菜籽粕中硫苷含量最低为优化目标，对菜籽粕混菌固态发酵参数进行优化，为加强菜籽粕在饲料生产和动物养殖中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料菜籽粕购自湖南省粮油食品进出口集团有限公司，粉碎，过60目筛，测定菜籽粕中硫苷含量。发酵菌种购自武汉丰甜生物科技有限公司，商品名为FT粕类发酵菌种，主要成分为植物乳杆菌、芽孢杆菌、酵母菌等，有效活菌数为1×108 CFU/g。使用方法为每千克菜籽粕中至少添加2 g混合菌剂，初始发酵温度不低于28 ℃，加水，混合均匀，密封发酵不低于60 h。1.2试验设备与试剂1.2.1试验设备JG-FS200L型粉碎机（广州钧工机械设备有限公司）、JC-TP型电子天平（青岛精诚仪器仪表有限公司）、DZ91T型真空烘箱（河南泰斯特仪器有限公司）、HH-4恒温水浴锅（常州隆和仪器制造有限公司）、紫外分光光度计（绍兴苏珀仪器有限公司）、试管加热器（绍兴苏珀仪器有限公司）、TG16G型离心机（常州市亿能实验仪器厂）。1.2.2试验试剂无水磷酸氢二钠、氯化钠、钨酸钠、苯酚、浓盐酸、弱阴离子交换树脂（DEAE Sephadex A-25）、氢氧化钠、冰乙酸、无水乙酸钠、三羟甲基氨基甲烷、黑芥子硫苷酸酶（200 U/g）、4-氨基安替吡啉、葡萄糖氧化酶（20 000 U/66.67 mg）、过氧化物酶（10 000 U/52.6 mg）、苯甲酸、无水葡萄糖标准品，所有试剂均为分析纯，水为蒸馏水。1.2.3溶液制备苯酚-钨酸溶液：称取5.0 g钨酸钠、5.0 g无水磷酸氢二钠和9.0 g氯化钠于500 mL容量瓶中，使用约350 mL水溶解，使用2 mol/L盐酸溶液调节pH值至3.0，加入2.0 g苯酚，用水定容至500 mL。氢氧化钠溶液：称取20 g氢氧化钠溶解，定容至1 L。乙酸钠缓冲液：称取16.5 g无水乙酸钠和11.5 mL冰乙酸溶解于950 mL水中，使用2 mol/L盐酸溶液调节pH值至4.9，用水定容至1 L。Tri-HCl缓冲液：称取1.6 g三羟甲基氨基甲烷溶于900 mL水中，使用2 mol/L盐酸溶液调节pH值至7.0，用水定容至1 L。黑芥子硫苷酸酶溶液：称取500 mg黑芥子硫苷酸酶于10 mL容量瓶中，加水溶解并定容。葡萄糖显色溶液：称取10 g无水磷酸氢二钠于盛有750 mL水的1 L容量瓶中，加入131.7 mg葡萄糖氧化酶于容量瓶中摇匀，称取16.7 mg过氧化物酶和333 mg 4-氨基安替吡啉于盛有约10 mL水的烧杯中，搅拌，溶解，定容，保存至棕色瓶，-4 ℃冷藏。葡萄糖标准储备液：将无水葡萄糖于40 ℃真空烘箱中干燥4 h，冷却，称取1.000 0 g葡萄糖于烧杯内，加入1 g苯甲酸，用水定容至1 L。1.3硫苷的检测方法抗营养因子硫苷的检测参考SN/T 1868—2007《进出口油菜籽及其饼粕中硫代葡萄糖苷总量的测定方法》。灭酶和提取：称取0.2 g菜籽粕样品于13 mm×100 mm具螺旋盖试管中，将试管置于加热器中100~120 ℃灭酶1 h，试管中加入2 mL沸水，加盖混匀，置于加热器中100~120 ℃提取1 h，室温冷却，加入2 mL常温水，3 000 r/min离心10 min，取上清液移至10 mL容量瓶，样品各以2 mL水提取2次，将上清液合并至同一容量瓶中，用水定容至10 mL，混匀。水解：准确移取适量样品提取溶液于层析柱，排干。使用3 mL Tris-HCl缓冲液沿柱壁淋洗层析柱，向层析柱中加入1.0 mL黑芥子硫苷酶溶液，关闭活塞，在柱上加盖，37 ℃恒温水浴溶解1 h。洗脱：取出层析柱，使用6 mL水分6次洗脱层析柱，将洗脱液收集于10.0 mL容量瓶中，加入2.0 mL苯酚-钨酸溶液，用水定容至10 mL，混匀。测定：将洗脱液移入离心管，3 000 r/min离心10 min。准确移取上清液1.0 mL溶液于13 mm×100 mm试管中，加入3.0 mL葡萄糖显色溶液，加盖混匀，37 ℃恒温水浴中保温30 min，取出，冷却至室温，采用紫外分光光度计在505 nm波长下测定吸光度。标准曲线制作：准确移取0、0.10、0.20、0.40、0.60、1.00、1.50、2.00 mL葡萄糖储备液于10 mL容量瓶中，每个容量瓶中加入2 mL苯酚-钨酸，用水定容。分别准确移取葡萄糖标准工作溶液1.0 mL于13 mm×100 mm试管，每个试管中加入3.0 mL葡萄糖显色溶液，混匀，37 ℃恒温水浴保温30 min，试管取出，冷却至室温，使用紫外分光光度计在505 nm波长下测定吸光度，以0 mL葡萄糖管作为空白校正，计算直线回归方程。W=X×100/(m×V)(1)式中：W为样品中硫苷含量（μmol/g）；X为回归方程算得测定溶液中的葡萄糖量（μmol）；m为样品质量（g）；V为上柱样品提取液的体积（mL）。1.4单因素试验根据混合菌剂的推荐使用方法，本研究以硫苷含量最低为目标对发酵参数进行优化，采用单因素轮换法对混合菌剂接种量、发酵温度、发酵时间依次考察。在发酵温度28 ℃、发酵时间60 h条件下，观察混合菌剂接种量（2、3、4、5、6 g/kg）对菜籽粕中硫苷含量的影响。在混合菌剂接种量2 g/kg、发酵时间60 h条件下，观察发酵温度（28、30、32、34、36 ℃）对菜籽粕中硫苷含量的影响。在混合菌剂接种量2 g/kg、发酵温度28 ℃条件下，观察发酵时间（60、90、120、150、180 h）对菜籽粕中硫苷含量的影响。1.5正交试验根据单因素试验结果，确定影响菜籽粕发酵后硫苷含量的影响因素为混合菌剂接种量（A）、发酵温度（B）、发酵时间（C），每个因素设3个水平。L9(34)正交试验设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.019.T001表1L9（34）正交试验设计水平A混合菌剂接种量/(g/kg)B发酵温度/℃C发酵时间/h133090243212035341501.6数据统计与分析采用Excel软件对数据进行初步整理，采用SPSS软件对数据进行正交分析，结果以平均值表示。2结果与分析2.1未发酵菜籽粕中硫苷含量（见表2）由表2可知，未发酵菜籽粕中硫苷的平均含量为156.75 μmol/g。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.019.T002表2未发酵菜籽粕中硫苷含量项目123456平均值硫苷含量157.28153.40156.33159.27158.19156.05156.75μmol/g2.2单因素分析结果2.2.1混合菌剂接种量对发酵菜籽粕中硫苷含量的影响（见图1）由图1可知，随着混合菌剂接种量的提高，菜籽粕中硫苷含量逐渐降低。当接种量超过4 g/kg时，其对硫苷降解的作用趋于平缓。因此，将混合菌剂接种量的最佳范围区间设置为3~5 g/kg。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.019.F001图1混合菌剂接种量对发酵菜籽粕中硫苷含量的影响2.2.2发酵温度对发酵菜籽粕中硫苷含量的影响（见图2）由图2可知，菜籽粕中硫苷含量随着发酵温度的提高呈先下降后上升的趋势，在32 ℃时硫苷含量达到最低。因此，发酵温度的最佳范围为30~34 ℃。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.019.F002图2发酵温度对发酵菜籽粕中硫苷含量的影响2.2.3发酵时间对发酵菜籽粕中硫苷含量的影响（图3）由图3可知，随着发酵时间的延长，菜籽粕中硫苷含量呈下降趋势，在120 h后硫苷的降解速度趋于平缓。因此，发酵时间的最佳范围为90~150 h。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.019.F003图3发酵时间对发酵菜籽粕中硫苷含量的影响2.3正交优化试验结果（见表3~表5）由表3可知，3种因素的主次顺序为：发酵时间混合菌剂接种量发酵温度。由表4可知，发酵时间对菜籽粕中硫苷的含量有显著影响（P0.05），混合菌剂接种量与发酵温度对硫苷含量的影响不显著（P0.05）。根据极差分析结果并以硫苷含量最低为优化目标，最佳的发酵参数为混合菌剂接种量5 g/kg、发酵温度32 ℃、发酵时间150 h。混合接种菌剂与发酵温度对硫苷含量的影响不显著。因此，从经济角度出发，本研究认为，发酵条件可以调整为混合菌剂接种量3 g/kg、发酵温度32 ℃、发酵时间150 h。最优参数与调整后参数条件下菜籽粕中硫苷含量见表5。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.019.T003表3正交试验结果项目A混合菌剂接种量/(g/kg)B发酵温度/℃C发酵时间/h硫苷含量/(μmol/g)15349039.19233215016.35353015017.32433412035.29543415023.12653212027.8274329052.35843012043.8293309058.30k136.6539.8149.95k239.9132.1735.64k328.1132.5318.93R11.807.6431.0210.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.019.T004表4方差分析结果项目Ⅲ型平方和自由度均方F值P值校正模型1 775.846295.9736.170.027截距10 924.43110 924.431 335.020.001A混合菌剂接种量218.392109.19413.340.070B发酵温度111.50255.756.810.128C发酵时间1 445.952722.9888.350.011误差16.3728.18校正的变异1 792.218注：F0.05（2，2）=19.00；F0.01（2，2）=99.03。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.019.T005表5最优参数与调整后参数条件下菜籽粕中硫苷含量项目123456平均值最优参数硫苷含量14.9815.4717.2216.2016.9915.0015.94参数调整硫苷含量15.4816.7017.3315.2116.3017.0816.35μmol/g由表5可知，最优参数条件下，菜籽粕中硫苷含量平均为15.94 μmol/g，调整参数条件下菜籽粕中硫苷含量平均值为16.35 μmol/g。3讨论对菜籽粕中抗营养因子进行脱毒处理主要方法包括物理脱毒、化学脱毒和生物学脱毒法。研究发现，利用微生物法效率最高，可以使菜籽粕中硫苷降解率高达90%[6]。微生物脱毒法具有多种优点：（1）条件简单、营养物质损失少[7]。（2）微生物可以利用抗营养因子合成营养物质，提高菜籽粕饲用价值[8]；经微生物处理后可以改善菜籽粕风味；微生物种类越多，在复合菌剂的使用下可以产生更多分解硫苷等抗营养因子的酶，效果随着微生物种类的增多而提升[9]。吴逸飞等[10]使用芽孢杆菌对菜籽粕进行处理，发现菜籽粕经发酵后硫苷降解率可达60.89%。徐鑫等[11]使用植物乳杆菌对菜籽粕进行发酵，结果表明，使用植物乳杆菌发酵可使菜籽粕中硫苷含量降低56.42%。方洁等[12]使用酵母菌对菜籽粕进行发酵，发现菜籽粕中硫苷、芥子碱、植酸等物质均明显降解。吴正可[13]研究混菌固态发酵对菜籽粕饲用价值的影响，认为混菌固态发酵菜籽粕最佳比例为嗜酸乳杆菌∶枯草芽孢杆菌∶酿酒酵母为1∶3∶2，正交试验结果发现，混菌固态发酵菜籽粕的最佳条件为发酵温度33 ℃、发酵时间84 h、料液比1∶1、接种量6%。嵇乐乐[14]以解淀粉芽孢杆菌、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌作为混合菌剂发酵菜籽粕，研究发现，枯草芽孢杆菌∶酿酒酵母∶解淀粉芽孢杆菌最佳比例为2∶3∶1，最佳条件为接种量30%、发酵温度37 ℃、料液比1∶1.2，接种枯草芽孢杆菌与酿酒酵母发酵48 h后，再接种解淀粉芽孢杆菌发酵 48 h，硫苷降解率可高达99.04%。研究表明，在发酵过程中添加适量水分可能更有助于硫苷降解[15]。4结论经过微生物处理后，菜籽粕中的抗营养因子可大量降解。使用植物乳杆菌、芽孢杆菌、酵母菌混合菌剂对菜籽粕进行固态发酵，建议发酵条件为混合菌剂接种量3 g/kg、发酵温度32 ℃、发酵时间150 h。此条件下，菜籽粕中硫苷平均含量为16.35 μmol/g。