反刍动物瘤胃是密闭的发酵罐，瘤胃中的细菌、原虫、真菌和古生菌等组成庞大的柔性生态系统，能够降解单胃动物不能降解的纤维并给机体提供能量。瘤胃中微生物种类和数量的改变能够反映瘤胃发酵特征。黄酮类化合物是植物次生代谢产物，在植物中广泛存在，具有抗氧化、抑菌等功效。Orhan等[1]报道，黄酮类化合物能够有效杀灭绿脓假单胞菌、金黄色葡萄球菌等多种病原细菌以及克鲁斯假丝酵母等真菌甚至病毒。研究表明，富含黄酮化合物的印度苦楝树种子提取物和意大利蓟叶子提取物能够降低瘤胃原虫的数量；黄酮、杨梅酮、儿茶素、芦丁和山柰酚等能够降低瘤胃微生物数量；柚皮苷和槲皮素能够抑制产甲烷菌和原虫数量；而问荆草提取物、贯叶金丝桃花提取物和鼠尾草叶提取物对原虫数量无影响[2-4]。在反刍动物瘤胃中黄酮类化合物能够调控瘤胃微生物菌群，但不同来源和结构的黄酮类化合物对瘤胃微生物的影响不同。竹叶黄酮与其他黄酮类物质相似，具有抑菌、抗病毒等作用。竹叶提取物中的黄酮在体外模型下可以降低瘤胃液中氨态氮（NH3-N）和丁酸浓度，提高总挥发性脂肪酸（TVFA）浓度[5]。目前，关于竹叶黄酮对肉牛瘤胃微生物数量和发酵特征的影响未见报道。因此，本研究考察不同剂量竹叶提取物对肉牛的生产性能、瘤胃微生物数量以及瘤胃发酵特征的影响，为竹叶提取物在肉牛养殖中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料试验所用竹叶提取物购自四川裕沣商贸有限公司，其组分包括总黄酮（41.2%）、粗蛋白质（13.2%）、水溶性多糖（15.4%）、粗灰分（20.5%）和其他成分（9.7%）。1.2试验设计试验选取24头6月龄、体重（259.30±12.17）kg的西门塔尔杂交公牛，分为4组，每组6头牛。各组肉牛日粮中分别添加0（对照组）、40、80、120 g/d竹叶提取物。按照《肉牛饲养标准》[6]和（NY/T 815—2004）配制日粮。基础日粮组成及营养水平见表1。全混合日粮与竹叶提取物混匀，撒入料槽供肉牛采食。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.004.T001表1基础日粮组成及营养水平（干物质基础）原料组成含量/%营养水平合计100.00玉米26.50综合净能/(MJ/kg)5.11麦麸3.50粗蛋白/%12.00豆粕2.00酸性洗涤纤维/%27.55棉粕5.30中性洗涤纤维/%47.77尿素0.20粗脂肪/%2.32大豆油0.20钙/%0.73碳酸钙0.70磷/%0.48磷酸氢钙0.20硫酸钠0.20小苏打0.40氯化钠0.50预混料0.30白酒糟30.00皇竹草青贮30.00注：1.预混料为每千克日粮提供：VA 8 000 IU、VD3 1 000 IU、VE 60 IU、铁50 mg、铜10 mg、锌60 mg、锰40 mg、硒0.2 mg、碘0.2 mg、钴0.1 mg。2.营养水平中综合净能为计算值，其余均为实测值。1.3饲养管理本试验于2020年9月~2021年2月在四川巨力农业开发有限公司进行。试验开始前，做好圈舍清洁和消毒等准备工作。肉牛进场后，对肉牛皮下注射伊维菌素注射液驱虫，驱虫完成，进入预试期。预试期14 d，正式试验期180 d。试验牛采用舍饲分栏拴系饲养，每头牛占栏位面积约3.0 m2。每天按预估采食量供给全混合日粮，分别在8：00和17：00各饲喂1次。试验期间自由采食和饮水。1.4测定指标及方法1.4.1生产性能正式试验期第1、180 d清晨，对试验肉牛空腹称重，计算平均日增重。正式试验期间每天记录采食量，根据日粮投喂量和剩料量计算平均日干物质采食量。根据平均日增重和平均日采食量计算料重比。平均日增重(ADG)=(末重-初重)/试验天数(1)平均日干物质采食量(ADMI)=每头牛总干物质采食量/试验天数(2)料重比(F/G)=平均日干物质采食量/平均日增重(3)1.4.2瘤胃发酵参数试验结束当天晨饲前，采用口腔导管法采集瘤胃液，弃去最初50 mL瘤胃液（避免唾液的影响），4层纱布过滤，分装于15 mL离心管和5 mL冻存管中，15 mL离心管-20 ℃保存，用于检测瘤胃内发酵参数指标，如微生物蛋白（MCP）、挥发性脂肪酸（VFA）以及氨态氮（NH3-N）；5 mL样品液氮中保存，用于微生物数量的测定。采用便携式pH计测定瘤胃液pH值；采用冯宗慈等[7]的比色法测定NH3-N值；采用CP-3800气相色谱仪FID检验器测定VFA。OV-1701型毛细管（30 m×0.32 mm×0.5 μm），2000色谱数据工作站，内标分析法，内标物为巴豆酸。升温程序：初温80 ℃，初时3.5 min，升速30 ℃/min，终温180 ℃，终时10 min。进样室温度260 ℃，检测器温度260 ℃；柱前压力0.05 MPa，氮气作为载气，样品进样量1 μL。1.4.3瘤胃液微生物数量采用十六烷基三甲基溴化铵法提取瘤胃液微生物基因组总DNA，凝胶电泳法（1.5%）检测其完整性，采用酶标仪测定所得总DNA纯度、。委托大连宝生物有限公司进行引物的设计与合成。引物设计见表2。使用灭菌超纯水将引物配制成100 μmol/L贮备液和20 μmol/L工作液，-20 ℃保存。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.004.T002表2引物设计项目引物和探针序列（5'→3'）产物大小/bp总细菌上游：ATGAATAAGCCACGGCTAACT下游：AAATGACCCACATTTCCCGC探针：CGGATAACGCTCGCCACCTACG88厌氧真菌上游：TACCGATTGAATGGCTTAGTG下游：ATTTTCAGCATTGTTCCAAAAGG探针：TCCTCTAAATGACCAAGTTTGCCCA125产琥珀酸拟杆菌上游：CGGGATTGAATGTACCTTGAG下游：TAGTCCTTCTTGTGGCTACC探针：ACGCATTCCACCGCTACACCAGG251白色瘤胃球菌上游：AGGTAGTTGGTGAGGTAATGG下游：ACATTTGGAGACAGAAGCCC探针：CCACCAAGCCGACGATCAGTAGCC201黄化瘤胃球菌上游：AATGACGGTACTTTAGGAGGAA下游：AATGACCCACATTTCCCTCG探针：CTAACTACGTGCCAGCAGCCGC103实时荧光定量PCR反应过程：95 ℃条件下进行预变性3 min；95 ℃变性30 s，55 ℃条件下退火30 s，72 ℃延伸30 s，整个反应过程进行35~40个循环；72 ℃延伸15 min。1.5数据统计与分析采用Excel 2010软件进行数据整理，采用SAS 9.4混合模型进行单因素方差分析，采用Tukey法进行多重比较，对竹叶提取物添加水平进行线性和二次曲线的拟合分析，结果以平均值和总标准误表示。P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1竹叶提取物对肉牛生产性能的影响（见表3）由表3可知，竹叶提取物对肉牛的平均日增重和平均干物质采食量均有显著影响（P0.05），随添加剂量呈二次曲线变化（P0.05），80 g/d组的平均日增重和平均干物质采食量均显著高于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.004.T003表3竹叶提取物对肉牛生产性能的影响项目对照组40 g/d组80 g/d组120 g/d组SEM值P值处理线性二次初重/(kg)258.50257.40259.30261.409.340.8840.7850.865末重/(kg)560.90572.40599.50592.606.550.0760.1220.134平均日增重/[kg/(头·d)]1.68b1.75ab1.89a1.84a0.110.0430.0230.035平均干物质采食量/[kg/(头·d)]11.39b11.95b13.52a13.10ab0.980.0370.0240.032料重比6.786.837.167.120.560.1730.1560.224注：同行数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.2竹叶提取物对肉牛瘤胃发酵参数的影响（见表4）由表4可知，竹叶提取物对肉牛瘤胃微生物蛋白、总挥发性脂肪酸、乙酸、丙酸浓度以及乙酸/丙酸均有显著影响（P0.05），总挥发性脂肪酸、乙酸、丙酸以及乙酸/丙酸随添加剂量呈二次曲线变化（P0.05）。120 g/d组肉牛瘤胃微生物蛋白含量显著高于对照组（P0.05）。竹叶提取物添加组总挥发性脂肪酸浓度均显著高于对照组（P0.05）。80、120 g/d组的乙酸比例均显著低于对照组（P0.05），丙酸比例显著高于对照组和40 g/d组（P0.05）。竹叶提取物添加组乙酸/丙酸均显著低于对照组（P0.05），80、120 g/d组乙酸/丙酸显著低于40 g/d组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.004.T004表4竹叶提取物对肉牛瘤胃发酵参数的影响项目对照组40 g/d组80 g/d组120 g/d组SEM值P值处理线性二次pH值6.456.536.736.640.460.3650.4430.562氨态氮/(mg/L)143.30134.70135.50136.801.110.1780.2370.334微生物蛋白/(g/L)1.44b1.54ab1.57ab1.63a0.030.0340.0530.136总挥发性脂肪酸/(mmol/L)75.44b78.56a79.45a80.35a4.670.0320.0230.034乙酸/%70.22a67.45ab64.35b65.64b3.570.0370.0310.045丙酸/%18.45c20.22b22.25a23.45a1.140.0340.0220.024丁酸/%9.439.548.969.530.460.1320.3220.235乙酸/丙酸3.81a3.33b2.89c2.80c0.020.0010.0010.0012.3竹叶提取物对肉牛瘤胃细菌数量的影响（见表5）由表5可知，竹叶提取物饲对肉牛瘤胃内总细菌、厌氧真菌、白色瘤胃球菌和黄化瘤胃球菌数量具有显著影响（P0.05），且随添加剂量呈二次曲线变化（P0.05）。80、120 g/d组瘤胃内总细菌、厌氧真菌和黄化瘤胃球菌数量均显著高于对照组（P0.05），80、120 g/d组瘤胃内白色瘤胃球菌均数量显著高于对照组（P0.05），且120 g/d组显著高于80 g/d组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.004.T005表5竹叶提取物对肉牛瘤胃细菌数量的影响项目对照组40 g/d组80 g/d组120 g/d组SEM值P值处理线性二次总细菌14.23b18.55ab25.33a27.56a5.790.0010.0010.001厌氧真菌0.32b0.46ab0.78a0.84a0.050.0010.0010.001产琥珀酸拟杆菌0.230.250.320.350.020.1760.0320.021白色瘤胃球菌0.67c0.98ab1.34b1.65a0.050.0010.0010.001黄化瘤胃球菌0.12b0.18ab0.36a0.47a0.010.0010.0010.001106 copies/mL3讨论3.1竹叶提取物对肉牛生产性能的影响关于黄酮类植物提取物作为饲料添加剂在动物中的应用的报道较多，但关于竹叶提取物作为饲料添加剂的报道较少。刘艳丰[8]报道，添加0.25%和0.50%沙棘叶黄酮组肉羊的ADG明显增加，0.25%组肉羊的ADFI显著增加。陈圣阳等[9]报道，使用11（低浓度黄酮组）、22（中浓度黄酮组）和33 mg/kg沙葱黄酮（高浓度黄酮组）饲喂肉羊70 d，结果表明，日粮添加沙葱黄酮试验第30~45 d和第46~60 d，各试验组肉羊的平均日采食量均明显高于对照组，且高浓度黄酮组肉羊的平均日采食量最高；试验第46~60 d，各试验组肉羊的平均日增重明显提高，料重比明显降低。目前，未见竹叶提取物对肉牛生产性能影响的报道。本试验中，添加80 g/d的竹叶提取物可以提高肉牛ADMI，添加80和120 g/d能够提高ADG，与Shen等[10]在肉鸡上的研究结果相近。3.2竹叶提取物对肉牛瘤胃发酵参数的影响肉牛特殊的消化道结构，任何饲料或添加剂进入瘤胃后首先对瘤胃微生物产生影响，进而改变瘤胃发酵特征，从MCP合成和VFA组分两方面改变动物机体的能量和蛋白代谢。栗明月[11]报道，在体外条件下，添加3.0、4.5、6.0 mg/g竹叶提取物能够明显提高发酵液中乙酸和TVFA含量，降低丁酸含量；4.5和6.0 mg/g组明显提高了发酵液中丙酸含量，但对pH值无影响；3.0和4.5 mg/g竹叶提取物可以明显降低奶牛瘤胃发酵液中NH3-N含量。杨春涛等[12]研究发现，与对照组相比，56日龄桑叶黄酮组犊牛瘤胃中TVFA和丁酸含量明显提高；42日龄乙酸/丙酸有升高的趋势。白齐昌等[13]报道，日粮中添加0.4%和0.5%沙棘黄酮组的瘤胃发酵液MCP浓度明显高于对照组；0.1%和0.3%组发酵液丙酸浓度明显高于其他各组；0.3%组发酵液TVFA浓度最高。研究发现，添加竹叶提取物可以降低瘤胃中NH3-N浓度，提高MCP产量、TVFA含量、丙酸比例，降低乙酸/丙酸，使瘤胃发酵由乙酸型转变为丙酸型发酵。因此，竹叶提取物具有提高日粮能量利用效率的潜力，可在一定程度上解释肉牛日增重提高的原因。3.3竹叶提取物对肉牛瘤胃细菌数量的影响瘤胃中微生物在功能上相互促进、相互抑制。黄化瘤胃球菌、白色瘤胃球菌产琥珀酸拟杆菌和溶纤维丁酸弧菌等的主要功能是降解纤维[14]，均能够产生大量木聚糖酶，降解日粮中纤维素和半纤维素。王帅等[15]研究发现，在田羊日粮中添加10、30、50 mg/kg小花棘豆黄酮，与对照组相比，试验羊瘤胃液中总细菌数均有不同程度升高，从第21 d开始，添加10和30 mg/kg组瘤胃液总细菌数均明显高于对照组，表明黄酮类物质能够促进微生物生长，但是存在剂量效应。本试验中，瘤胃内总细菌、厌氧真菌以及黄化瘤胃球菌、白色瘤胃球菌的数量均升高，说明黄酮类物质可能提高日粮纤维物质的消化率。Zhan等[16-17]使用苜蓿类黄酮提取物饲喂奶牛发现，苜蓿类黄酮提取物可提升瘤胃微生物多样性，改善牛奶品质，提高饲料消化率。Kong等[18]将类黄酮饲喂犊牛，瘤胃微生物纤维素消化能力明显提升。王梦竹等[19]在基础日粮中添加0.1%、0.2%和0.4%苜蓿黄酮，与对照组相比，0.4%组木糖酶、内切葡聚糖酶、纤维二糖酶和纤维素酶活性升高。因此，苜蓿黄酮可能提高了黄化瘤胃球菌、白色瘤胃球菌等的相对丰度。刘水[20]报道，在小鼠气性坏疽感染模型中，穗花杉双黄酮可以延长感染小鼠的存活时间，降低感染小鼠组织内的细菌存活率，有效减轻病理损伤；在肉鸡坏死性肠炎模型中，给予穗花杉双黄酮可以有效缓解产气荚膜梭菌坏死性肠炎引起的肠道胀气、肠壁出血等病理性损伤，能够降低肠道内厚壁菌门、梭菌纲及梭菌目的相对丰度。黄酮类物质可以优化胃肠道内菌群组成，降低有害菌丰度，改善瘤胃健康，提高纤维降解菌相对丰度，因此可以改变瘤胃发酵特征。4结论日粮添加竹叶提取物可以提高肉牛瘤胃黄化瘤胃球菌、白色瘤胃球菌等数量，提高瘤胃内丙酸浓度，降低乙酸/丙酸，提高微生物蛋白合成和日增重；竹叶提取物的适宜添加量为80 g/d。