蛋白酶是断裂蛋白质一级肽键结构，可将蛋白质水解为多肽和氨基酸。组合蛋白酶是由催化水解同一底物，配合来源和特性不同的两种或两种以上蛋白酶制成的酶制剂[1]。研究表明，日粮中添加蛋白酶可改善畜禽的生长性能，提高营养物质表观消化率，降低排泄物中氮含量，减轻养殖业对环境的污染[2-5]。但不同蛋白酶自身特性、日粮组成、目标动物及使用方法的不同，其应用效果不同[6]。本试验应用3个来源不同的微生物菌种发酵制备酸性蛋白酶、中性蛋白酶和角蛋白酶的单体蛋白酶按一定比例配制组合蛋白酶，通过在玉米-豆粕型、玉米-杂粕型和小麦-杂粕型日粮中的应用研究，探讨其对育肥猪生长性能、营养物质表观消化率和氮利用率的影响，为合理配制育肥猪日粮、提高蛋白质的利用效率、降低养猪氮排放对环境的污染提供参考。1材料与方法1.1试验材料组合蛋白酶由酸性蛋白酶、中性蛋白酶和角蛋白酶按3∶3∶4配制（河南省工业酶工程技术研究中心提供）。酸性蛋白酶由黑曲霉yy07菌株固体发酵制备，酶活≥15 000 U/g；中性蛋白酶由枯草芽孢杆菌YKS03工程菌液体发酵制备，酶活≥15 000 U/g；角蛋白酶由枯草芽孢杆菌YKM05工程菌液体发酵制备，酶活≥40 000 U/g。酸性蛋白酶、中性蛋白酶执行标准：GB/T 28715—2012；角蛋白酶执行标准：GB/T 23527—2009。1.2试验动物选取120头体重约60 kg、健康去势的“杜×长×大”三元杂交猪，按照体重相近、公母各半的原则随机分为3组，每组4个重复，每个重复10头猪。试验猪采用圈舍群饲，每舍饲养10头。1.3饲养管理试验于2021年5月~6月在河南省罗山县鑫隆家庭农场养猪场进行。试验猪舍漏缝地板，温度、湿度和通风采用自动控制，保持25 ℃。每天8：00、18：00定时饲喂。不锈钢料槽自由采食，以食槽无剩料为原则，采用鸭舌式自动饮水器饮水。按日常管理程序进行消毒和驱虫。每天清扫，保持圈舍卫生。1.4试验日粮依据“杜×长×大”三元杂交猪的饲养标准（GB/T 5915—2008和DB23/T 2384—2019），配制等消化能（13.42 MJ/kg）、等粗蛋白水平（粗蛋白为14.50%）的玉米-豆粕型、玉米-杂粕型和小麦-杂粕型日粮。日粮组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.007.T001表1日粮组成及营养水平项目玉米-豆粕型玉米-杂粕型小麦-杂粕型原料组成/%玉米74.0075.0039.85豆粕17.0011.856.75麸皮5.0000小麦0040.15菜籽粕05.005.00DDGS04.004.00赖氨酸00.150.254%预混料4.004.004.00合计100.00100.00100.00营养水平消化能/(MJ/kg)13.4213.4213.42粗蛋白质/%14.5014.5014.50赖氨酸/%0.620.620.62蛋氨酸+胱氨酸/%0.500.500.50钙/%0.590.590.59总磷/%0.560.560.56注：1.每千克预混料为日粮提供：VA 4 500 IU、VD3 750 IU、VE 22.5 IU、VK3 2.5 mg、VB1 5 mg、VB2 5 mg、VB6 2.5 mg、VB12 25 μg、核黄素5 mg、烟酸30 mg、泛酸20 mg、氯化胆碱375 mg、铁90 mg、铜30 mg、锰20 mg、锌75 mg、碘0.2 mg、硒0.15 mg。2.营养水平中消化能为计算值，其余均为实测值。1.5试验设计3组的试验猪分别饲喂玉米-豆粕型、玉米-杂粕型和小麦-杂粕型日粮。每组中2个重复设为对照，不添加组合蛋白酶；2个重复设为试验，添加0.1%的组合蛋白酶。预试期7 d，正式试验期40 d。1.6测定指标及方法1.6.1样品采集试验期间分别抽取玉米-豆粕型、玉米-杂粕型和小麦-杂粕型日粮样品500 g，检测各种营养物质含量。试验结束的前5 d，采用全收粪法和全收尿法收集3组不同类型日粮的试验猪与对照猪全部粪尿，计算平均日排粪量和平均日排尿量。向盛放尿样的桶内加入尿样体积10%的硫酸进行固氮。将同组同期试验猪和对照猪的粪样和尿样分别混合均匀，制成试验样品，按试验样品的10%取样，-18 ℃保存。1.6.2生长性能试验期开始和试验期结束当天8：00，空腹称重，记录试验猪体重数据，计算试验期间育肥猪的平均日增重。试验期间记录每个圈舍每天试验猪的采食量，计算平均日采食量和料重比。平均日增重(g/d)＝(末重-初重)/试验天数(1)平均日采食量(g/d)＝试验期间总采食量/(试验天数×试验猪头数)(2)料重比＝平均日采食量/平均日增重(3)1.6.3营养物质表观消化率日粮和粪便样品中的干物质含量采用GB/T 6435—2014测定；粗蛋白含量采用GB/T 6432—2018测定；粗脂肪含量采用GB/T 6433—2006测定；粗纤维含量采用GB/T 6434—2006测定。日粮营养物质表观消化率采用盐酸不溶灰分（AIA）为内源指示剂，AIA含量采用GB/T 23742—2009测定。日粮营养物质表观消化率＝100%-[(日粮中指示剂含量/粪样中指示剂含量)×(粪样中养分含量/日粮中养分含量)]×100%(4)1.6.4氮利用率取冰箱中的粪、尿样品化冻，同组试验猪和对照猪的粪样和尿样分别混匀。将粪样置于60 ℃烘箱，烘至恒重，回潮24 ｈ，粉碎，测定氮含量。尿样直接测定氮含量。粪、尿样品中氮含量采用GB/T 6432—2018测定。根据猪平均日采食量、日均排粪量、日均排尿量，计算每日氮摄入量、粪便中氮的排放量、尿中氮的排放量以及氮的利用量，计算氮的利用率。饲料中氮摄入量(g/d)＝平均日采食量×日粮中氮含量(5)粪便中氮排放量(g/d)＝平均日排粪量×粪中氮含量(6)尿中氮排放量(g/d)＝平均日排尿量×尿液中氮含量(7)氮利用量(g/d)＝饲料中氮摄入量-粪便中氮排放量-尿中氮排放量(8)氮利用＝氮利用量/饲料中氮摄入量×100%(9)1.7数据统计与分析数据采用SPSS 19.0统计软件进行统计分析，结果以“平均值±标准差”表示。P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1不同日粮添加组合蛋白酶对育肥猪生长性能的影响（见表2）由表2可知，与对照猪相比，试验猪平均末重和平均日增重均极显著增加（P0.01）。饲喂玉米-豆粕型日粮试验猪平均日增重显著低于玉米-杂粕型和小麦-杂粕型日粮（P0.05），平均日采食量增加，料重比降低，但差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.007.T002表2不同日粮添加组合蛋白酶对育肥猪生长性能的影响组别初重/kg末重/kg平均日增重/(g/d)平均日采食量/(g/d)料重比玉米-豆粕型日粮组对照猪60.18±0.7792.25±1.33Bb801.75±1.61Bc2 389.22±1.06ab2.98±0.89试验猪60.05±0.8095.90±0.68Aa896.25±5.32Ab2 455.73±39.54a2.74±0.08玉米-杂粕型日粮组对照猪60.01±0.6991.51±0.99Bb785.25±8.80Bd2 371.46±16.88b3.02±0.06试验猪60.11±0.3696.53±1.40Aa910.50±9.40Aa2 421.93±43.87ab2.66±0.11小麦-杂粕型日粮组对照猪60.09±0.3091.48±1.13Bb784.75±5.32Bd2 377.79±3.27b3.03±0.07试验猪60.04±0.4896.21±0.32Aa904.25±11.73Aa2 414.35±68.08ab2.67±0.20注：同列数据肩标不同大写字母表示差异极显著（P0.01），不同小写字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.2不同日粮添加组合蛋白酶对育肥猪营养物质表观消化率的影响（见表3）由表3可知，与对照猪相比，不同日粮试验猪干物质、有机物、粗蛋白、粗脂肪和粗纤维的表观消化率极显著提高（P0.01）；玉米-杂粕型日粮组试验猪的有机物表观消化率显著高于其他各组（P0.05）；玉米-杂粕型和小麦-杂粕型日粮的试验猪粗蛋白的表观消化率显著高于玉米-豆粕型日粮（P0.05）；玉米-豆粕型日粮试验猪粗脂肪的表观消化率极显著低于玉米-杂粕型和小麦-杂粕型日粮（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.007.T003表3不同日粮添加组合蛋白酶对育肥猪营养物质表观消化率的影响组别干物质有机物粗蛋白粗脂肪粗纤维玉米-豆粕型日粮组对照猪82.28±0.73Bb85.56±0.19Cd76.72±0.31Bc75.36±0.08Cc41.88±0.81Bb试验猪84.31±0.61Aa86.87±0.09Bc78.91±0.53Ab79.44±0.17Bb48.92±0.06Aa玉米-杂粕型日粮组对照猪82.23±0.38Bb85.07±0.14Cd75.33±0.74Cd74.18±0.33Cd40.17±0.11Bb试验猪85.63±1.23Aa88.73±0.28Aa80.10±0.74Aa83.26±0.82Aa50.14±2.05Aa小麦-杂粕型日粮组对照猪81.60±0.80Bb84.87±0.26Cd75.56±0.49Cd74.65±0.56Cc40.38±0.58Bb试验猪84.48±0.73Aa87.80±0.97ABb79.49±0.22Aa82.61±0.60Aa49.42±0.61Aa%2.3不同日粮添加组合蛋白酶对育肥猪氮利用率的影响（见表4）由表4可知，与对照猪相比，不同日粮试验猪氮摄入量显著提高（P0.05），粪便和尿中氮排放量极显著降低（P0.01），氮利用量和氮利用率极显著提高（P0.01）。不同日粮试验猪相比，粪便中氮排放量玉米-豆粕型日粮极显著高于玉米-杂粕型和小麦-杂粕型日粮（P0.01），尿中氮排放量和氮利用量方面差异不显著（P0.05），玉米-杂粕型日粮氮利用率显著高于玉米-豆粕型和小麦-杂粕型日粮（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.007.T004表4不同日粮添加组合蛋白酶对育肥猪氮利用率的影响组别氮摄入量/(g/d)粪便中氮排放量/(g/d)尿中氮排放量/(g/d)氮利用量/(g/d)氮利用率/%玉米-豆粕型日粮组对照猪55.43±0.18b5.69±0.10Bb20.78±0.29Bb28.96±0.76Bb52.25±0.09Bc试验猪56.97±1.16a5.05±0.07Cc17.42±0.70Cc34.50±0.31Aa60.56±0.82Ab玉米-杂粕型日粮组对照猪55.02±0.77b5.78±0.05Bb22.7±0.74Aa26.54±0.39Cc48.24±0.85Cd试验猪56.19±0.59a4.53±0.06Ee16.80±0.31Cc34.86±0.34Aa62.04±0.57Aa小麦-杂粕型日粮组对照猪55.16±0.98b6.16±0.12Aa23.12±1.02Aa25.88±0.60Cc46.92±0.90Cc试验猪56.01±0.18a4.82±0.03Dd17.23±0.38Cc33.96±0.93Aa60.63±1.04Ab3讨论3.1不同日粮添加组合蛋白酶对育肥猪生长性能的影响蛋白酶在猪日粮中的应用效果并不一致。王彩玲等[7]研究表明，在饲粮中添加复合蛋白酶制剂能够显著提高育肥猪日增重和饲料消化率，有效降低腹泻率。O'Shea等[8]研究表明，在育肥猪菜粕-小麦-酒糟日粮中添加0.02%的蛋白酶明显提高育肥猪的平均日增重和采食量。Han等[9]研究发现，酸性蛋白酶可提高仔猪的生长性能。李元凤等[10]在“杜×长×大”三元杂交仔猪的低蛋白日粮中添加500 mg/kg角蛋白酶，结果发现，试验猪的末重、平均日增重和料重比与正常日粮无显著差异。刘景环等[11]在仔猪日粮中添加300 mg/kg的木瓜蛋白酶，结果发现，仔猪的采食量和平均日增重分别提高2.70%和2.56%。卢晨等[12]研究发现，在玉米-豆粕型日粮中添加中性和酸性蛋白酶可以不同程度地提高断奶仔猪的平均日增重，降低料重比。张荣飞等[13]研究显示，添加0.08%~0.12%的角蛋白酶可明显提高断奶仔猪的平均日增重，降低料重比。侯玉煌等[14]在苏淮断奶仔猪日粮中添加0.1~0.2 g/kg酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶，结果表明，仔猪的生长性能明显提高，与Lim等[15]研究结果一致。Mc Alpine等[16]在育肥猪的小麦麸-菜粕-小麦-大麦型日粮中添加0.02%的蛋白酶，结果发现，育肥猪的平均日采食量和平均日增重明显降低。本试验中，在育肥猪玉米-豆粕型、玉米-杂粕型和小麦-杂粕型日粮中添加组合蛋白酶，育肥猪的平均日增重明显增加，平均日采食量增加，料重比降低。因此，日粮类型、生理阶段、蛋白酶来源和自身的特性等可能是造成上述应用效果不一致的原因。3.2不同日粮添加组合蛋白酶对育肥猪营养物质表观消化率的影响猪日粮中添加蛋白酶即可补充内源酶的不足，能够促进内源酶的分泌，从而有效提高饲料营养成分的利用率[17]。Pan等[18]在“杜×长×大”三元猪的日粮中添加0.02%的包被复合蛋白酶，结果发现，饲料中干物质、总能、粗蛋白质以及有机物的表观消化率均明显提高。Wang等[19]在生长猪的玉米-豆粕型饲粮中添加0.05%和0.1%的角蛋白酶，结果表明，饲料中粗蛋白质等营养物质的表观消化率均明显提高。Zuo等[20]在玉米-豆粕型饲粮中添加0.01%~0.03%的蛋白酶，结果表明，仔猪日粮中营养物质表观消化率显著提高。Yu等[21]研究发现，蛋白酶可明显提高仔猪日粮中粗蛋白表观消化率。李建沅等[22]将两种酸性蛋白酶和一种中性蛋白酶配制的复合蛋白酶分别在鲁烟白猪的3种日粮中添加1 000 mg/kg，结果显示，玉米-豆粕型日粮粗蛋白表观消化率差异不显著，玉米-杂粕型和小麦-杂粕型日粮营养物质表观消化率明显增加。姜建阳等[23]在鲁烟白猪育肥猪日粮中添加复合蛋白酶，蛋白质和氨基酸的表观消化率明显提高，其中玉米-杂粕型日粮中的效果较优。叶慧等[24]将酸性蛋白酶和中性蛋白酶添加至仔猪玉米-全脂大豆-乳清粉型日粮中，结果表明，能量和粗蛋白的表观消化率分别提高6.08%和7.53%。侯玉煌等[14]在苏淮断奶仔猪日粮中添加0.1~0.2 g/kg酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶，日粮中干物质、有机物、粗蛋白和粗脂肪的表观消化率明显提高。本试验结果表明，在育肥猪3种类型的日粮中添加组合蛋白酶，日粮干物质、有机物、粗蛋白、粗脂肪和粗纤维的表观消化率均明显提高。不同类型日粮添加组合蛋白酶，其营养成分表观消化率的趋势表现为玉米-杂粕型日粮小麦-杂粕型日粮玉米-豆粕型日粮，表明组合蛋白酶在杂粕型日粮中的应用效果优于豆粕型日粮。因此，在玉米-豆粕型日粮中添加组合蛋白酶可以用小麦和杂粕替代一定比例的玉米和豆粕，不影响育肥猪对干物质、有机物、粗蛋白、粗脂肪和粗纤维等营养物质的消化吸收。在玉米、豆粕供应紧张或价格明显过高时，用小麦和杂粕替代部分玉米和豆粕是降低育肥猪养殖成本的有效途径。3.3不同日粮添加组合蛋白酶对育肥猪氮利用率的影响猪日粮中20%以上的蛋白质并不能被消化利用，而随粪便和尿液排出体外，造成蛋白质资源浪费，污染环境[25]。蛋白酶能够增加畜禽对蛋白质原料的消化吸收，提高蛋白质的利用率，从而减少氮的排放[17]。Pan等[18]研究表明，在“杜×长×大”三元猪的玉米-豆粕型日粮中添加200 mg/kg包被复合蛋白酶，饲料中氮的利用率显著增加，粪便中氮的排放量明显降低，尿液中氮的排放量有降低的趋势。李建沅等[22]在3种类型日粮中添加1 000 mg/kg复合蛋白酶，对猪氮的利用率和氮的生物学价值均有显著的促进作用，且在玉米-杂粕型日粮中效果最明显。本试验结果显示，在育肥猪的3种类型日粮中添加组合蛋白酶，氮摄入量明显提高，粪便和尿中氮排放量显著降低，饲料中氮利用量和利用率明显提高。不同类型日粮粪便和尿中氮排放量的趋势表现为玉米-豆粕型日粮小麦-杂粕型日粮玉米-杂粕型日粮；玉米-杂粕型日粮氮的利用率明显高于小麦-杂粕型和玉米-豆粕型日粮。本试验不同类型日粮虽然粗蛋白含量相同，但其来源不同，育肥猪对不同类型日粮中粗蛋白的利用能力产生差异，从而影响育肥猪对不同日粮中氮的利用率。本试验中，育肥猪对豆粕中氮的利用率高于杂粕，但添加组合蛋白酶后，由于酸性蛋白酶、中性蛋白酶和角蛋白酶的共同作用，造成两种杂粕型日粮中氮的利用率高于豆粕型日粮，而粪便和尿中氮的排放量则低于豆粕型日粮。4结论添加组合蛋白酶的日粮对育肥猪的生长性能有促进作用，对饲料中的营养物质表观消化率有显著提高，对粪尿中氮的排放量有显著的降低作用。