家禽养殖业的集约化、高密度的发展模式导致肉仔鸡疾病易感率上升[1]。在日粮中添加抗生素可以提高肉仔鸡的生长性能及抗病能力，但过量使用抗生素会对机体造成伤害，降低机体抗病能力[2]。镧系稀土添加在动物日粮中，能够促进动物增产；动物体内的稀土绝大部分会排出体外且沉积量极少。在孕鼠日粮中添加400 mg/kg剂量的稀土，胎鼠未出现致畸作用，且对其后代无不良影响[3]。在日粮中添加稀土元素（铈和镧）能够提高动物的繁殖性能、血浆中钙和磷浓度、平衡肝脏及血液中的抗氧化剂[4]，能够通过提高外周白细胞的数量及增强中性粒细胞和巨噬细胞的吞噬功能提高机体的非特异性免疫[5]。壳聚糖作为饲料添加剂明显提高动物的生长性能和免疫球蛋白M（IgM）含量，促进免疫器官生长[6-7]。将壳聚糖作为稀释载体包裹稀土，经特殊电化学工艺加工制成稀土壳糖胺螯合盐（rare earth-chitosan chelate，RECC）[8]。RECC中的活性基团可与活性氧发生反应以减少机体氧化应激[9]，能够通过细胞表面Toll样受体4（TLR4）或核转录因子（NF-κB）信号通路调节机体免疫功能[10]。RECC可提高断奶仔猪体内生长激素含量，调节微生物平衡，进而改善仔猪生长性能、免疫等功能[11]。因此，本试验研究日粮中添加不同剂量RECC对肉仔鸡脾脏免疫及抗氧化功能的影响，探讨其在肉鸡日粮中的适宜添加量，为RECC在禽类日粮中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验设计试验用稀土壳糖胺螯合盐购自深圳市希科安实业有限公司。稀土壳糖胺螯合盐主组分含量不低于32%，稀土有效成分为铈和镧。试验在内蒙古农业大学试验鸡舍内进行。选取192只1日龄爱拔益加（AA）肉仔鸡，随机分为4组，每组6个重复，每个重复8只鸡（公、母各半）。在基础日粮中分别添加0（对照组）、150、200、250 mg/kg的RECC。试验期42 d。1.2饲养管理试验所用基础日粮参照NRC（1994）和NY/T 33—2004配制，分为前期（1~21日龄）和后期（22~42日龄）两个阶段。各阶段营养成分均满足肉鸡营养需要标准。基础日粮组成及营养水平见表１。试验期间人工控制舍内光照、温度，自然通风。第1 w舍内温度保持33 ℃，之后每周降低3 ℃，达到21 ℃时保持稳定。舍内湿度保持50%~60%。7日龄使用新城疫点眼首次免疫；10日龄皮下注射鸡新城疫灭活疫苗；14日龄进行鸡传染性法氏囊灭活疫苗滴鼻；20日龄进行新城疫、传染性支气管炎二联灭活疫苗滴鼻。试验期间肉仔鸡自由采食和饮水。1.3测定指标及方法1.3.1脾脏免疫及抗氧化指标试验第21、42 d，每个重复随机选取1只鸡屠宰，分离脾脏，分装于锡箔纸及冻存管中，用于测定组织中免疫、抗氧化指标及其相关基因表达。称取0.5 g脾脏组织，按1∶9（质量体积比）在4 ℃0.9%生理盐水中均浆，匀浆液置于4 ℃、3 000×g离心15 min，上清液于-80 ℃保存。采用考马斯亮蓝法测定脾脏匀浆液上清中的蛋白浓度，采用抗氧化试剂盒（南京建成生物工程研究所）测定样品中总抗氧化能力（T-AOC），丙二醛（MDA）含量，总超氧化物歧化酶（T-SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）及过氧化氢酶（CAT）活性。采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测试剂盒（泉州睿信生物科技有限公司）测定样品中白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-4（IL-4）、白细胞介素-6（IL-6）及免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白M（IgM）、免疫球蛋白G（IgG）含量。测定方法均按照试剂盒内说明书进行。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.009.T001表1基础日粮组成及营养水平（风干基础）项目1~21日龄22~24日龄原料组成/%玉米52.5058.80豆粕40.0033.80豆油3.003.00磷酸氢钙1.901.80石粉1.081.22食盐0.370.37赖氨酸0.050.03蛋氨酸0.190.07预混料0.800.80胆碱0.110.11合计100.00100.00营养水平代谢能/(MJ/kg)12.4212.62粗蛋白/%21.7719.65钙/%1.001.02有效磷/%0.440.42赖氨酸/%1.341.15蛋氨酸/%0.550.40胱氨酸0.400.36蛋氨酸+胱氨酸/%0.950.76苏氨酸/%0.400.38色氨酸/%1.020.87注：1.预混料为每千克日粮提供：VA 9 000 IU、VD3 3 000 IU、VE 26 IU、VK3 1.20 mg、VB1 3.00 mg、VB2 8.00 mg、VB6 4.40 mg、VB12 0.012 mg、盐酸45 mg、叶酸 0.75 mg、生物素0.20 mg、胆碱1 100 mg、泛酸钙15 mg、铁100 mg、铜10 mg、锌108 mg、锰120 mg、碘1.5 mg、硒0.35 mg。2.营养水平中粗蛋白为测定值，其余均为计算值。1.3.2脾脏总RNA提取、反转录和实时荧光定量PCR采用RNAiso Plus试剂（TaKaRa）提取脾脏组织中总RNA。提取出的总RNA采用核酸定量仪在260、280 nm处进行定量和定性测定，使用1.5%琼脂糖凝胶电泳测定RNA完整性。总RNA通过Hifair® Ⅱ 1st Strand试剂盒（Yeasen Biotech）逆转录为cDNA；将β-肌动蛋白（β-actin）做为内参基因，通过罗氏LightCycler®96 qPCR仪和Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix试剂盒（Yeasen Biotech）实时定量PCR，各样品重复数为2，程序设定如下为95 ℃、30 s，循环1次（预热）；95 ℃、5 s，60 ℃、33 s，循环35次（扩增）；95 ℃、15 s，60 ℃、60 s，95 ℃、15 s，循环1次（溶解曲线）。采用2-ΔΔCt[12]法计算脾脏不同处理组中TLR3，TLR4，髓样分化因子88（MyD88）、NF-κB p65、NF-κB p50、IL-6及Nrf2、CAT、SOD、GPx-7的相对表达量。免疫及抗氧化相关基因引物序列见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.009.T002表2免疫及抗氧化相关基因引物序列基因名称引物序列（5'→3'）GenBank登录号长度/bpβ-ActinF：GCCAACAGAGAGAAGATGACACNM_205518118R：GTAACACCATCACCAGAGTCCATLR3F：TAACACCCCGCCTAAATATCANM_001011691229R：CACTCCCGGTAGTCTGTCAAGTLR4F：TTCAGAACGGACTCTTGAGTGGNM_001030693131R：CAACCGAATAGTGGTGACGTTGMyD88F：CCTGGCTGTGCCTTCGGANM_001030962198R：TCACCAAGTGCTGGATGCTANF-κB p65F：CAGCCCATCTATGACAACCGD13721151R：CAGCCCAGAAACGAACCTCNF-κB p50F：GAAGGAATCGTACCGGGAACANM_20513480R：CTCAGAGGGCCTTGTGACAGTAAR： ACTGTGGTGTGCTCAGAATCCIL-6F：AAATCCCTCCTCGCCAATCTHM179640106R：CCCTCACGGTCTTCTCCATAAASODTTGTCTGATGGAGATCATGGCTTCNM_205064.198TGCTTGCCTTCAGGATTAAAGTGACATGTTGGCGGTAGGAGTCTGGTCTNM_001031215.1182GTGGTCAAGGCATCTGGCTTCTGGPx7CAAAGTTGCGGTCAGTGGANM_001163245.1136AGAGTCCCAGGCCTTTACTACTTTCNrf2GATGTCACCCTGCCCTTAGNM_205117.1215CTGCCACCATGTTATTCC1.4数据统计与分析采用Excel 2010对试验数据进行初步整理，采用SAS 9.2软件进行线性回归分析，结果以平均值和SEM表示。P0.01表示差异极显著，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1稀土壳糖胺螯合盐对肉仔鸡脾脏免疫指标及相关因子的影响（见表3、表4）由表3可知，随RECC添加剂量的升高，试验前期脾脏组织中IgG含量呈显著的一次线性或二次曲线升高效应（P0.05），IL-2含量呈极显著的一次线性或二次曲线升高效应（P0.01），IgM含量呈极显著的一次线性（P0.01）或显著的二次曲线（P0.05）升高效应，IL-4含量呈显著的一次线性（P0.05）或趋于显著的二次曲线（P=0.065）升高效应，IL-1β含量呈显著一次线性或二次曲线降低效应（P0.05）。试验后期脾脏IgA和IL-4含量均表现出极显著的二次曲线升高效应（P0.01），IgM和IL-2含量则呈显著的二次曲线升高效应（P0.05），而IL-6含量呈显著的一次线性（P0.05）或极显著的二次曲线（P0.01）降低效应。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.009.T003表3稀土壳糖胺螯合盐对肉仔鸡脾脏免疫指标的影响项目对照组150 mg/kg组200 mg/kg组250 mg/kg组SEMP值线性二次21 dIgA/(mg/g prot)14.3115.4514.5515.640.3530.1930.447IgG/(mg/g prot)85.3487.1295.7797.472.0000.0110.015IgM/(mg/g prot)32.3336.2937.7839.011.1940.0020.011IL-2/(ng/g prot)8.499.289.7711.190.3410.0010.001IL-4/(ng/g prot)6.236.426.487.130.2470.0470.065IL-1β/(ng/g prot)31.6036.0932.5641.472.1080.0260.047IL-6/(ng/g prot)1.591.601.621.670.0600.5250.74742 dIgA/(mg/g prot)15.7618.5814.6812.390.7080.2090.007IgG/(mg/g prot)99.92121.77109.9499.596.8140.8140.206IgM/(mg/g prot)36.2748.4241.0933.512.3240.9680.020IL-2/(mg/g prot)12.0215.3217.0112.620.5190.2320.014IL-4/(ng/g prot)7.108.277.515.910.3010.5130.005IL-1β/(ng/g prot)39.6746.9434.7437.932.1590.5620.372IL-6/(ng/g prot)1.732.031.261.230.0900.0190.007由表4可知，试验第21 d，随着RECC添加剂量的升高，肉仔鸡脾脏中TLR4和NF-κB p65表达量呈显著的一次线性或二次曲线降低效应（P0.05），MyD88表达量呈现显著的一次线性降低效应（P0.05）；NF-κB p50表达量呈趋于显著的一次线性降低效应（P=0.081），而TLR3表达量呈显著的一次线性或二次曲线降低效应（P0.05）。试验第42 d，肉仔鸡脾脏中NF-κB p65表达量均表现出极显著的一次线性降低效应（P0.01），TLR4表达量呈极显著的一次线性（P0.01）或显著的二次曲线（P0.05）降低效应，IL-6表达量呈趋于显著的一次线性（P=0.054）或极显著的二次曲线（P0.01）降低效应；TLR3表达量则表现出趋于显著的一次线性（P=0.065）或显著的二次曲线（P0.05）升高效应。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.009.T004表4稀土壳糖胺螯合盐对肉仔鸡脾脏免疫相关基因表达的影响项目对照组150 mg/kg组200 mg/kg组250 mg/kg组SEMP值线性二次21 dTLR31.000.890.860.900.0260.0150.048TLR41.000.870.740.890.0320.0270.047MyD881.000.980.930.950.0120.0450.137NF-κB p651.000.890.750.860.0280.0150.040NF-κB p501.000.900.910.880.0240.0810.148IL-61.000.910.860.910.0380.2170.40342 dTLR31.001.141.351.080.0470.0650.040TLR41.000.950.770.830.0240.0050.022MyD881.000.950.960.810.0390.1100.189NF-κB p651.000.760.530.670.0210.0010.001NF-κB p501.000.740.951.030.0560.8840.126IL-61.001.120.810.640.0220.0540.0012.3稀土壳糖胺螯合盐对肉仔鸡脾脏抗氧化指标及相关因子的影响（见表5、表6）由表5可知，试验第42 d，随着RECC添加剂量的升高，脾脏中的GSH-Px活性呈显著的一次线性或二次曲线升高效应（P0.05）；T-AOC及SOD的活性呈显著（P0.05）或极显著（P0.01）的二次曲线升高效应；而脾脏中MDA的含量呈显著的一次线性（P0.05）或趋于二次曲线（P=0.073）降低效应。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.009.T005表5稀土壳糖胺螯合盐对肉仔鸡脾脏抗氧化指标的影响项目对照组150 mg/kg组200 mg/kg组250 mg/kg组SEMP值线性二次21 dCAT/(U/mg prot)1.201.461.171.460.1290.4570.746SOD/(U/mg prot)230.23280.64304.88271.7024.5600.2180.313GSH-Px/(U/mg prot)38.5640.3839.8941.561.4690.2910.582T-AOC/(μmol/g prot)83.5694.2984.9892.992.4440.1420.264MDA/(μmol/g prot)0.770.650.550.840.0430.8280.10142 dCAT/(U/mg prot)1.521.351.401.520.1450.3960.631SOD/(U/mg prot)100.44205.71168.99147.8518.5700.2360.043GSH-Px/(U/mg prot)38.3648.0356.3246.142.5430.0180.020T-AOC/(μmol/g prot)73.85113.0888.2272.383.2500.7880.001MDA/(μmol/g prot)1.331.360.850.970.0940.0320.073由表6可知，试验后期，随着RECC添加剂量的升高，肉仔鸡脾脏中Nrf2和GPx-7均表现出显著的一次线性或二次曲线升高效应（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.009.T006表6稀土壳糖胺螯合盐对肉仔鸡抗氧化相关因子的影响项目对照组150 mg/kg组200 mg/kg组250 mg/kg组SEMP值线性二次21 dNrf21.001.001.261.110.0330.1240.265CAT1.001.001.051.020.0480.8070.968SOD1.001.051.131.040.0330.4260.614GPx-71.000.850.920.940.0460.2910.54542 dNrf21.001.071.231.160.0240.0100.038CAT1.001.021.071.010.0310.3430.609SOD1.001.051.111.070.0340.2520.513GPx-71.001.121.321.210.0360.0130.0473讨论3.1稀土壳糖胺螯合盐对肉仔鸡脾脏免疫及抗氧化指标的影响脾脏作为体积最大的免疫器官，本质结构类似于淋巴结，能够使聚集于白髓部的T、B淋巴细胞再循环，从而歼灭有害菌[12]。小剂量的稀土元素可以刺激辅助性T淋巴细胞1（Th1）和辅助性T淋巴细胞2（Th2）型细胞的细胞分化，进而产生IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等多种细胞因子，提高机体细胞免疫和体液免疫功能[13]。镧系离子可以上调核因子κB抑制蛋白（IκBα）蛋白表达，进而改善炎症反应[14]。壳糖胺作为一种还原性单糖，可以增强巨噬细胞的吞噬能力，激活T淋巴细胞并分泌信号因子促使B细胞活化，促进免疫球蛋白的分泌，进而提高机体免疫力[15]。RECC可以通过提高体内酶活性，进而通过自身毒性作用启动非特异性免疫[16]，或在降解后影响花生四烯酸的合成与释放启动体内特异性免疫应答[10]。因此，RECC可以提高机体免疫力。本试验中，肉仔鸡饲喂RECC后，肉仔鸡脾脏前期、后期IL-2、IL-4的含量均明显提高，试验后期IL-6含量明显下降，表明RECC可通过调节细胞因子改善机体炎症反应，与Huang等[14]研究结果一致。IgM、IgG是体现动物体液免疫功能的重要指标。本试验中，由于RECC添加量的不同，肉仔鸡脾脏IgM、IgG含量也发生变化。试验前期，IgM、IgG含量均比对照组显著提高；试验后期，IgG含量呈二次曲线显著上升。结果表明，RECC可促进免疫球蛋白的分泌，进而改善机体免疫能力。因此，RECC作为饲料添加剂可以增强肉仔鸡的免疫能力，且免疫球蛋白和白介素含量与RECC添加量之间呈剂量依赖效应。过多的活性氧（ROS）会加快体内细胞的迁移和凋亡，导致脂质、蛋白质和DNA受损，并与多种病理过程相关[17]。为了应对这一现象，细胞自身也进化出了酶和非酶抗氧化剂的抗氧化系统[18]。纳米CeO具有出色的CAT和T-SOD模拟还原再生特性，具有较强的抗炎、抗氧化和抗纤维等作用，可以清除细胞质ROS，抑制由氧化诱导的细胞核DNA损伤[19]。本试验结果表明，与对照组相比，饲喂RECC日粮后，肉仔鸡的脾脏中T-SOD、GSH-Px活性显著提高。Li等[20]研究发现，镧可以缓解由氧化应激导致的血清和肝脏中T-SOD和GSH-Px活性的降低，从而保护机体免受氧化损伤，与本试验结果相似。壳糖胺可以调节体内抗氧化酶系统，进而提高自由基的清除能力。因富含氨基、羟基等活性基团，壳糖胺具有较强的抗氧化活性[21]。本试验结果表明，日粮添加RECC可提高肉仔鸡脾脏中T-AOC、T-SOD、GSH-Px与CAT的活性，降低MDA含量，且均与RECC添加水平呈剂量依赖效应，与上述研究结果相似。壳聚糖可以提高肉鸡和断奶仔猪GSH-Px、T-AOC、T-SOD等抗氧化性能，降低MDA含量[22]。因此，RECC抗氧化效果优于稀土及壳糖胺单独使用。3.2稀土壳糖胺螯合盐对肉仔鸡脾脏基因表达的影响Toll样受体家族作为天然免疫系统的重要部分，可通过直接在T淋巴细胞和B淋巴细胞上表达或引起级联反应，促进树突状细胞和巨噬细胞活化，将抗原呈递给淋巴细胞使其增殖分化，进而激活免疫反应[23]。TRL3主要位于细胞内体膜上，是TLR家族中唯一能够永久性识别独一无二的dsRNA结构的成员[24]。TLR4作为革兰氏阴性菌外膜成分脂多糖的受体，能够在各种免疫细胞、上体细胞及内皮细胞中大量表达，诱导Ⅰ型干扰素及促炎因子表达。二者均在抗病毒、抗肿瘤等方面发挥重要作用。TLR3和TLR4均能够通过MyD88依赖性信号转导通路进行免疫反应[25]，通过激活IL-1R相关激酶（IRAK）家族激酶，激活NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶通路，转录释放炎症因子IL-1、IL-6等，激活炎症免疫反应[26]。作为调节免疫、炎症的重要核转录因子，NF-κB下游的两个主要亚基p50和p65在受到感染源或炎症细胞因子刺激时会发生核转位，释放多种炎症因子[27]。镧元素可以阻断LPS诱导的NF-κB/p65核转位，使炎症基因处于沉默状态，从而抑制炎症因子IL-1、IL-6的分泌，进而改善炎症反应[28]。壳寡糖可明显抑制NF-κB下游因子IL-6的基因表达，抑制NF-κB亚基p50和p65的表达[29]，具有抗炎效果。本试验研究发现，与对照组相比，RECC显著降低了TLR4、MyD88和NF-κB p65表达量，下调了炎症因子IL-6的表达水平，与上述结论一致。因此，RECC可以通过抑制TLR4/NF-κB信号通路来调节机体免疫。试验期间TLR3的含量均呈显著上升效应，表明RECC具有激活TLR3的能力，可以使机体免疫力低下时第一时间识别并杀死入侵病毒。Nrf2是调控抗氧化应激反应过程中的关键转录因子，可以诱导下游因子HO-1、SOD、CAT和GPx-7的基因表达[30]，清除过度产生的ROS。当机体受到刺激时，Nrf2与Keap1迅速分解并转移至细胞核中。本试验研究发现，脾脏中Nrf2表达水平的升高表明RECC可以激活Nrf2并与细胞核中抗氧化反应元件结合。Nrf2被激活后引起下游基因HO-1表达，从而发挥抗氧化能力。壳寡糖可以明显提高Nrf2和HO-1的表达水平，上调GPx-7和SOD的表达改善机体氧化应激[31-32]。本试验中，添加RECC可提高SOD的表达水平，且在试验后期表现较为显著。因此，推测RECC可以通过调节Nrf2表达水平来调控机体的抗氧化酶活性，进而提高抗氧化能力。4结论日粮中添加RECC可通过抑制TLR4/NF-κB信号通路，激活TLR3和Nrf2，提高抗氧化因子GPX-7的表达水平提高脾脏的免疫和抗氧化能力。