繁殖母猪哺育仔猪是养猪的重要环节，我国约有9.5%母猪发生产后无乳或少乳等泌乳障碍，严重影响仔猪的成活率和健仔率[1]。中医及中兽医典籍中均有催乳方记载。《中华人民共和国兽药典》中收录了“催奶灵散”、“通乳散”、“生乳散”等催乳药方[2]。在妊娠或泌乳母猪日粮中添加健脾胃、补气、活血化瘀、通经下乳的中草药复合添加剂，能够提高母猪泌乳能力，防止缺乳症的发生[3-7]，且对仔猪生长性能有一定的促进作用[8-9]。泌乳类中药材可促进小鼠乳腺上皮细胞增殖[10-12]，促进小鼠泌乳激素分泌[13-14]，提高小鼠免疫功能[15-16]；泌乳类中药材可以促进母猪泌乳激素分泌[17-19]，提高机体免疫力[20-21]及抗氧化能力[21-25]。吴姝[26]将自制的“芪归”催乳散分别饲喂母猪和母鼠，发现“芪归”催乳散能够促进母猪和母鼠催乳素分泌，提高仔猪和仔鼠窝重，促进哺乳母鼠乳腺腺泡的发育。研究认为，中药进入肠道后与肠道微生物相互作用是其发挥药效的关键[27-28]。本研究采用16S rRNA高通量测序比较分析催奶灵散对母鼠及其子鼠盲肠微生物菌群结构和多样性影响，检测分析子鼠生长性能、母鼠及其子代的免疫性能和抗氧化能力，分析探讨催奶灵散的药效机理，为催奶灵散在母畜上的应用提供参考。1材料与方法1.1催乳中草药制剂催奶灵散复方根据《中华人民共和国兽药典2010年版二部》[2]配制，王不留行20 g、黄芪10 g、龟角刺10 g 、当归20 g、党参10 g、川芎20 g、漏芦5 g、路路通25 g，均购自心连心大药房。将药材放于陶瓷煎药罐中，加入药量1倍体积蒸馏水，充分浸泡30 min，大火煮沸，调至小火煎煮30 min，过滤至大烧杯。药材残渣加入1倍药量体积的蒸馏水，煮沸，调至小火煎煮30 min，将药液过滤倒出，合并两次过滤药液，加压过滤。过滤液用旋转蒸发仪减压浓缩至含原生药浓度约0.3 g/L，4 ℃保存。1.2试验方法试验使用动物均为SPF昆明小鼠（武汉试验动物研究所）。分别选购6周龄、40只母鼠和10只公鼠，于实验室分开散养1 w，适应后按公、母比1∶3进行合笼10 d，取出雄鼠，观察母鼠的受孕状况，将确认妊娠的母鼠按照每笼1只进行单笼饲养至分娩。选取产仔时间前后相差不超过1 d、体重（55.00±2.00）g的产后母鼠20只，调整至每只母鼠带仔鼠10只，随机分为试验组和对照组。试验日粮以及垫料由试验动物研究所提供。分娩后第1 d至第21 d，每天8：00室温下对母鼠灌胃。试验组母鼠灌胃1.1制备的催奶灵散1 mL/(只·d)，对照组母鼠灌胃同等剂量的生理盐水。1.3测定指标及方法1.3.1子鼠生长性能记录试验子鼠初生窝重、7日龄窝重、14日龄窝重以及21日龄窝重，计算均重、平均日增重。均重=总窝重/试验只数（1）平均日增重=（末重-初重）/试验天数(2)1.3.2血清、组织生理生化指标子鼠21 d，母鼠、子鼠眼球取血，静止30 min，分离血清，4 ℃保存；母鼠采血后剥离皮肤，留取第四对乳腺右侧，使用生理盐水匀浆于4 ℃保存。分别采用Elisa试剂盒法检测催乳素（PRL）、免疫球蛋白（IgG）（泉州睿信生物科技有限公司）含量以及总蛋白含量、总抗氧化能力、溶菌酶含量（南京建成生物工程研究所）。1.3.3肠道微生物留取母鼠、子鼠盲肠内容物，采用16S rRNA对样品V3+V4可变区的PCR产物进行测序，送至北京诺禾致源科技股份有限公司检测。1.4数据统计与分析数据采用SPSS 18.0软件进行统计学分析，差异分析采用t检验，结果以“平均值±标准差”表示。P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。根据聚类得到的OTUs结果和研究需求，分析不同样本（组）之间共有、特有的OTUs，通过R软件（Version 3.0.3）分别绘制成花瓣图、物种相对丰度柱形图、物种丰度聚类热图、属水平物种进化树。2结果与分析2.1催奶灵散对子鼠生长性能的影响（见表1）由表1可知，子鼠出生1 w内，试验组子鼠均重极显著高于对照组（P0.01），平均日增重显著高于对照组（P0.05）。但第2 w、第3 w子鼠均重和平均日增重均极显著低于对照组（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.018.T001表1催奶灵散对子鼠生长性能的影响组别均重/g平均日增重/(g/d)出生第1 w第2 w第3 w第1 w第2 w第3 w对照组（F1）1.725±0.2844.003±0.226B7.860±0.577A14.050±1.538A0.326±0.042b0.551±0.112A0.885±0.160A试验组（F6）1.857±0.3324.742±0.238A6.060±0.284B8.032±0.765B0.412±0.057a0.188±0.071B0.282±0.132B注：1.F1指对照组仔鼠，F6指试验组仔鼠。2.同列数据肩标不同小写字母表示差异显著（P0.05），不同大写字母表示差异极显著（P0.01）；下表同。2.2催奶灵散对母鼠及其子鼠乳腺、血清生理生化指标的影响（见表2、表3）由表2、表3可知，试验组母鼠乳腺总抗氧化能力极显著高于对照组（P0.01），母鼠乳腺、血清以及子鼠血清中PRL含量、免疫球蛋白IgG含量、总蛋白含量、溶菌酶活性均无显著差异（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.018.T002表2催奶灵散对母鼠乳腺生理生化指标的影响组别总蛋白/(μg/g)溶菌酶/(mg/L)总抗氧化能力/(U/mL)IgG/(μg/g)对照组（P1）21.663±9.86917.143±4.2700.198±0.046B5 726.208±742.121试验组（P6）29.278±6.31018.000±7.1480.651±0.074A4 100.378±867.343注：P1指对照组母鼠，P6指试验组母鼠。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.018.T003表3催奶灵散对母鼠及子鼠血清生理生化指标的影响项目总蛋白/(μg/g)IgG/(μg/g)溶菌酶/(mg/L)PRL/(mg/L)母鼠对照组（P1）112.481±20.6613 210.636±158.6952.107±0.52824.439±0.851试验组（P6）139.106±15.7683 579.618±48.1972.286±0.38021.304±0.295子鼠对照组（F1）19.694±6.9693 487.133±114.0193.196±0.274—试验组（F6）86.033±16.2763 296.450±252.1432.286±0.667—2.3催奶灵散对肠道菌群结构的影响2.3.1测序数据分析经过质控过滤、去除嵌合体，将Effective Tags在97%的相似度水平下进行聚类，6个样品共获得OUTs 3 290个。样品多样性分析见图1。由图1可知，样本稀释曲线及物种累积箱形图曲线位置趋于平缓，表明抽样充分，可以进行数据分析。图1样品多样性分析10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.018.F1a1（a）样本稀释曲线10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.018.F1a2（b）物种累积箱形图曲线2.3.2肠道细菌群落结构组成根据物种注释结果，对四组样品在各分类水平上进行群落结构进行分析。母鼠及子鼠肠道菌群丰度见图2。图2母鼠及子鼠肠道菌群丰度10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.018.F2a110.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.018.F2a2由图2可知，在门水平，丰度排前10菌群依次为拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁门（Firmicutes）、变形门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、unidentified_Bacteria、软壁菌门（Tenericutes）、疣微菌门（Verrucomicrobia）、脱铁杆菌门（Deferribacteres）、Melainabacteria、酸杆菌门（Acidobacteria）。在属水平，鉴定出丰度排前10的菌群有乳杆菌属（Lactobacillus）、肉杆菌属（Alloprevotella）、拟杆菌属（Bacteroide）、瘤胃球菌科某属（unidentified_Ruminococcaceae）、苏黎世杆菌属（Turicibacter）、杜氏杆菌（Dubosiella）、副拟杆菌（parabacteroides）、Odoribacter、unidentified-Clostridiales、棒杆菌科某属（unidentified_Corynebacteriaceae）。2.3.3肠道细菌群落多样性分析2.3.3.1催奶灵散对母鼠及其子鼠盲肠菌群Alpha多样性的影响（见表4）由表4可知，本试验各样品coverage大于99.9%，说明各样本文库的覆盖率较高，能够代表样本中菌群落的真实信息，试验组和对照组ace、chao1、Shannon和Simpson、coverage、PD whole-tree无显著差异（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.018.T004表4催奶灵散对母鼠及其子鼠盲肠菌群Alpha多样性的影响组别observed_speciesgoods_coverageShannonPD_whole_treeSimpsonchao1aceP1971.667±124.1160.996±0.0006.433±0.251122.708±24.6660.954±0.0041 072.935±124.1111 120.336±120.118P6737.333±110.2000.997±0.0016.231±0.21277.289±8.8080.962±0.002821.008±125.040844.026±127.734F1798.667±170.3810.996±0.0016.032±0.37392.738±28.1470.946±0.014931.155±178.565951.731±180.198F6842.667±62.3680.996±0.0006.930±0.269101.140±12.1520.976±0.009948.968±69.980972.715±72.396OUT venn结果见图3。由图3可知，试验组母鼠肠道共鉴定出1 229个OTUs，对照组共有1 664个OTUs，其中共同OUTs有932个；其子代分别有1 460个OUTs、1 381个OTUs，其中共同的OUTs有918个。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.018.F003图3OUT venn结果2.3.3.2Beta多样性分析组间群落结构差异显著性检验表见表5。由表5可知，与对照组相比，试验组母鼠、子鼠肠道菌群结构均有差异（R=0.259 3、R=0.444 4），但差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.018.T005表5组间群落结构差异显著性检验表组别R值P值P6-P10.259 30.2F6-F10.444 40.1注：R=0表示组间无差异；R0表示组间差异大于组内差异，说明试验组和对照组之间存在差异；R0表示组间差异小于组内差异。小鼠肠道菌群在门水平和属水平上相对丰度热图见图4。母鼠及子鼠LDA值分布柱状图和进化分支见图5。图4小鼠肠道菌群在门水平和属水平上的相对丰度热图10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.018.F4a1（a）门水平10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.018.F4a2（b）属水平图5母鼠及子鼠LDA值分布柱状图和进化分支10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.018.F5a110.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.018.F5a210.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.018.F5a310.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.018.F5a4由图4可知，在门水平，试验组母鼠肠道拟杆菌门（Bacteroidetes）、疣微菌门（Verrucomicrobia）、（Melainabacteria）明显增加，放线菌门（Actinobacteria）略有增加，厚壁门（Firmicutes）明显减少；试验组子鼠肠道软壁菌门（Tenericutes）、酸杆菌门（Acidobacteria）、脱铁杆菌门（Deferribacteres）显著增加。在属水平，试验组母鼠拟杆菌门（Bacteroidetes）肉杆菌属（Alloprevotella）、苏黎世杆菌属（Turicibacter）、拟杆菌属（Bacteroide）、副拟杆菌（Parabacteroides）属增加，厚壁门（Firmicutes）杜氏杆菌（Dubosiella）显著降低；试验组子鼠厚壁门（Firmicutes）乳杆菌属（Lactobacillus）减少，瘤胃球菌科某属（unidentified_Ruminococcaceae）、Odoribacter、unidentified-Clostridiales明显增加。由图5可知，试验组母鼠Biomarker菌群为拟杆菌门拟杆菌纲拟杆菌目副拟杆菌属及Tannerellaceae和Actinobacteria，对照组为Clostridia纲Clostridiales目以及厚壁门。试验子鼠Biomarker菌群梭状芽孢杆菌目Clostridia、放线菌门、变形菌门。对每组属水平丰度前10的菌落进行功能预测，聚类分析和T检验结果见图6、图7。由图6、图7可知，催奶灵散试验组母鼠肠道菌群结构更倾向于尿素分解代谢和硝酸盐的代谢以及化能异养作用，试验组子鼠肠道中与硝酸盐代谢相关微生物显著高于对照组（P0.05），病原性腹泻等相关的菌群显著高对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.018.F006图6聚类分析10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.018.F007图7T检验3讨论目前，母猪产仔数逐渐接近生物潜力。随着总产仔数的升高，母猪泌乳量下降，严重影响仔猪断奶前存活率和断奶后的生长性能。从母猪妊娠后期或者分娩后饲喂催乳类中草药添加剂直至仔猪断奶，能够提高母猪泌乳性能和仔猪断奶窝重[7-9]。中草药提取物在适当浓度下才能够促进小鼠乳腺上皮细胞增殖，药量过高或者用药时间过长均会抑制乳腺上皮细胞增殖[29]，低浓度药物随着作用时间增加也会明显抑制细胞增殖[30]，具体作用机理目前还未见报道。本研究中，自母鼠分娩持续21 d灌胃，结果显示，母鼠乳腺总抗氧化能力极显著提高（P0.01），与已有报道一致。试验1 w后子鼠试验体均重明显高于对照组，但第2 w、第3 w子鼠均重和平均日增重极显著下降（P0.01）。该试验结果是否因乳腺细胞增殖下降从而影响子代生长需要进一步证明。肠道微生物结果显示，试验组子鼠biomarker菌群梭状芽孢杆菌目Clostridia、放线菌门、变形菌门；功能预测显示，试验组子鼠肠道中与病原性腹泻等相关的菌群显著高于对照组，可能是子鼠后期生长性能下降的原因。4结论催奶灵散能够影响泌乳母鼠肠道菌群结构和多样性和子代生长发育和肠道菌群结构。