斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）为辐鳍鱼纲鲈形目鱼类，体型较大，呈长椭圆形，广泛分布于太平洋以及印度洋的热带、亚热带海域[1]。近年来，养殖面积的扩张、放养密度的增加、气候的恶化及生态环境的破坏等问题导致水产养殖过程中各种病害频发，制约石斑鱼养殖业的发展[2]。但是，抗生素类药物治疗所引起的药物残留和耐药性问题严重[3]。因此，开发绿色环保型抗生素药物替代品至关重要。益生菌具有安全环保、无污染等特点，具有良好的应用前景。益生菌作为饲料添加剂能够促进动物对营养物质的消化与吸收，并为其提供维生素、氨基酸、有机酸等多种营养物质[4]。芽孢杆菌属作为益生菌在水产养殖中已被广泛应用，具有调节免疫的作用[5-6]。研究表明，在饲料中添加芽孢杆菌可以提高鱼的生长性能、消化酶活性、抗氧化能力、免疫反应和抗病性[7-10]。地衣芽孢杆菌属菌株（Bacillus licheniformis Dahb1）和短小芽孢杆菌（B. pumilus）能够提高越南巴沙鱼（Pangasius hypophthalmus）和尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）的生长性能[11-12]。Cha等[13]研究表明，芽孢杆菌作为饲料添加剂能够提高牙鲆（Paralichthys olivaceus）的生长性能，增强其先天免疫力和对海豚链球菌的抗病性。Yi等[14]报道，贝莱斯芽孢杆菌（B. velezensis JW）能够拮抗多种鱼类致病菌，对金鱼（Carassius auratus）具有良好的免疫保护作用。由于宿主生理条件不同，单一的益生菌种类不能满足所有宿主的需要[15]。Beck等[16]提出，将多种不同益生菌菌株混合会补充或增强单一菌株对宿主健康的促进作用。目前，关于复合芽孢杆菌在石斑鱼养殖中应用的研究较少。因此，本试验以斜带石斑鱼为研究对象，将从健康石斑鱼肠道中分离得到的3株芽孢杆菌等比例混合添加至石斑鱼饲料中，探究复合芽孢杆菌对石斑鱼生长性能、血清免疫指标、免疫基因表达水平和肠道菌群结构的影响，旨在为石斑鱼养殖中复合益生菌的开发与应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料饲喂试验所用菌株B. aerius B18、B. aryabhattai B20和B. licheniformis B25由本实验室于2019年从健康的斜带石斑鱼肠道分离获得，纯化后保存于医用超低温冰箱。石斑鱼基础饲料购自广东越群生物科技股份有限公司，营养水平为粗蛋白52%、粗纤维5%、粗脂肪8%、粗灰分16%、赖氨酸3%、总磷1.5%、水分10%。复合芽孢杆菌饲料制备方法如下：活化3株潜在的益生芽孢杆菌菌株，当菌株OD600 nm达到1时，各取3.3 mL菌液，4 ℃、6 000 r/min离心3 min，使用总体积50 mL PBS缓冲液重悬3株菌的菌体，加入100 g石斑鱼基础饲料中，使饲料充分吸收重悬菌液，晾干，4 ℃冰箱保存，每3 d制备1次复合芽孢杆菌饲料。1.2试验设计石斑鱼购自海南欣海生物科技有限公司，正式试验开始前，所有石斑鱼暂养2 w以适应实验室条件。选取120尾平均体重3.5 g的健康石斑鱼，随机分为2组，每组3个重复，每个重复20尾鱼，分别放入6个水容量为100 L的玻璃鱼缸内。循环补充海水，控制水温为28 ℃，盐度控制25‰~30‰。每天下午更换鱼缸中30%的水量，以保证水质。试验期间每天投喂2次，投喂量为石斑鱼体质量的2%，分别于8：30和16：30定时投喂。每14 d测1次石斑鱼体质量，每日投喂量由上一次测量鱼的总质量和其固定的投喂量共同决定。对照组饲喂石斑鱼基础饲料，试验组饲喂添加复合芽孢杆菌的基础饲料。试验期28 d。1.3测定指标及方法1.3.1生长性能饲喂试验第0、14和28 d称鱼的体质量，记录每天每组鱼的摄食量。称量前停食24 h，从对照组和试验组鱼缸中分别随机取9尾。试验结束最后1 d，计算体增重（WG）、特定生长率（SGR）、饵料系数（FCR）和肥满度（CF）。体增重(WG)=Wt-W0 (1)特定生长率(SGR)=(lnWt-lnW0)/t×100%(2)饵料系数(FCR)=WTC/[(Wt-W0)×n](3)肥满度(CF)=(Wt/L3)×100(4)式中：Wt为第28 d时鱼的体质量；W0为鱼初始体质量；t为养殖周期；WTC为试验阶段总摄食量；n为放养尾数；L为第28 d时鱼体长（cm）。1.3.2血清免疫指标饲喂试验结束，每组随机抽取9尾石斑鱼，采用穿刺尾静脉法取血，采集的血样置于4 ℃冰箱静置4 h，4 ℃、5 000 r/min离心10 min，收集上层血清用于血清免疫指标的检测。酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）、溶菌酶（LZM）、超氧化物歧化酶（SOD）活性及补体3（C3）含量的检测方法均按照南京建成生物工程研究所试剂盒说明书进行。1.3.3脾中免疫基因表达水平1.3.3.1RNA提取和cDNA的合成采用总RNA提取试剂盒检测（OMEGA）检测鱼脾中RNA，采用NanoDrop 2000 C定量检测RNA的浓度，获得的RNA置于-80 ℃医用低温保存箱保存。以提取的RNA为反转录模板，按照RevertAid™ First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo Fisher）试剂盒步骤合成cDNA第一条链。1.3.3.2实时荧光定量PCR（RT-qPCR）RT-qPCR反应采用Tip Green qPCR SuperMix（北京全式金生物技术有限公司）试剂盒。通过熔解曲线检测扩增过程的特异性，相关基因的表达水平通过Ct值进行计算。MHCIa为主要组织相容性复合物Ⅰ类多肽相关序列a，MHCIIa为主要组织相容性复合物Ⅱ类多肽相关序列a。实时荧光定量PCR所用引物见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.014.T001表1实时荧光定量PCR所用引物基因序列（5′→3′）片段大小/bpβ-actinF：TGTGTCATCTTCTCCCTGT19R：GAGAGGTATCCTGACTCTGAAGTA24细胞受体-β（TCR-β）F：ACACAGTCTGGCTCCCGTTGAA22GGGTCCCGCTCAGTGATTGG20免疫球蛋白M（IgM）F：ACCGTGACCCTGACTTGCTATG22CCCGATGGACCTGACAATAGC21MHCIaF：CCTCGGCAATGACTCACTCTCT22CAACCAACCCAACAACCACAAA22MHCIIaF：TGAAGATGATGGTGGTCCTGGT22TCTCCTCACCATCCAGAGCGTA22CD4F：TGGACTGATGGCAATGAACTGA22GCAGCGGAGTGGATGGTTTC20CD8aF：GTAAAGGAAGGGCAGCGGAT20TGATGCTGAAAGATGCGATGAAT231.3.4石斑鱼肠道菌群变化分析1.3.4.1肠道样品的采集饲喂试验结束，分别从对照组和试验组随机取9尾鱼，使用鱼宝（海南省文昌市东郊水产）对石斑鱼麻醉，每升水加入100 μL鱼宝（MS-222），混合均匀，放入石斑鱼麻醉2 min，使用75%乙醇擦拭鱼体表，取出鱼肠道，将其中肠道内含物挤出，放入2 mL离心管中，液氮速冻，于-80 ℃保存，用于肠道菌群变化的分析。1.3.4.2肠道样品的菌群变化分析将石斑鱼肠道样品送至广州基迪奥生物科技有限公司进行基因组DNA的提取和测序。以基因组DNA为模板，使用带有barcode的特异引物341F（5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3'）扩增16S rDNA的V3+V4区，构建测序文库，Illumina平台PE250上机测序。采用FLASH（version 1.2.7）[17]软件和Qiime（v1.9.1）[18]软件对测序原始数据（Raw Reads）进行拼接和过滤，得到数据为Clean Tags，对Clean Tags进行聚类，去除聚类比对过程中检测到的嵌合体Tag，获得有效数据Effective Tags。采用Uparse[19]软件在97%的相似水平上将Effective Tags聚类为OTUs。在上述数据处理的基础上，展开主成分分析（PCA）、Venn、物种组成和差异物种分析（LEfSe）。1.4数据统计与分析数据采用SPSS 18.0软件独立样本T检验进行样本间差异分析和单因素方差分析（One-way ANOVA），采用Duncan's法进行多重比较，结果以“平均值±标准差”。P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1复合芽孢杆菌对石斑鱼生长性能的影响（见表2）由表2可知，添加复合芽孢杆菌后试验组鱼的体增重、特定生长率均显著高于对照组（P0.05），试验组鱼的饵料系数显著低于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.014.T002表2复合芽孢杆菌对石斑鱼生长性能的影响组别初重/g末重/g体增重/g特定生长率/(%/d)饵料系数肥满度/(g/cm3)对照组3.83±0.2410.69±0.99b6.86±1.03b3.65±0.36b1.18±0.16a1.80±0.06试验组3.82±0.1514.52±1.30a10.70±1.39a4.75±0.12a0.75±0.10b1.90±0.27注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著（P0.05），不同大写字母表示差异极显著（P0.01），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.2复合芽孢杆菌对石斑鱼血清免疫相关酶活性的影响（见表3）由表3可知，与对照组相比，试验组石斑鱼血清中ACP、AKP、SOD的活性及C3的含量显著提高（P0.05）；试验组石斑鱼血清LZM活性极显著提高（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.014.T003表3复合芽孢杆菌对石斑鱼血清免疫相关酶活性的影响组别ACP/(金氏单位/100 mL)AKP(金氏单位/L)补体C3/(ng/L)SOD/(金氏单位/mL)LZM/(ng/L)对照组3.28±0.69b70.49±6.81b159.00±7.55b82.47±17.62b0.76±0.18B试验组7.98±1.53a135.70±15.11a457.33±35.97a197.72±18.66a2.91±0.41A2.3复合芽孢杆菌对石斑鱼脾中免疫基因表达量的影响（见表4）由表4可知，试验组鱼脾中IgM、MHCIIa和CD8a的表达量显著高于对照组（P0.05），MHCIa的表达量极显著高于对照组（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.014.T004表4复合芽孢杆菌对石斑鱼脾中免疫基因表达量的影响组别TCR-βIgMMHCIaMHCIIaCD4CD8a对照组1.01±0.171.00±0.07b1.02±0.22B1.00±0.10b1.00±0.011.00±0.11b试验组1.01±0.184.67±0.32a17.63±0.37A3.72±0.28a1.19±0.064.29±0.12a2.4复合芽孢杆菌对石斑鱼肠道菌群变化的影响2.4.1石斑鱼肠道样品测序数据石斑鱼肠道样品测序数据和OTU统计见表5。由表5可知，6个样品共获得632 515条序列。经过筛选、过滤、优化等过程，共获得507 390条有效的高质量的序列，平均有效数据比率约为80%。采用effective tags之间的序列相似性关系，可以将不同的tags聚类成OTU。采用Uparse软件对所有样品的全部Effective Tags序列聚类，以97%的一致性将序列聚类成为OTUs，两组肠道样品聚类后的OTUs分别为3 295和3 413。测序所获数据用于肠道菌群多样性分析。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.014.T005表5石斑鱼肠道样品测序数据和OTU统计项目原始序列高质量序列有效数据比率/%OTUs对照组-1107 38886 04580.131 472对照组-2108 11585 11178.721 162对照组-3101 67084 54583.16661试验组-1108 64185 16478.391 375试验组-2105 91585 62980.85955试验组-3100 78680 89680.271 0832.4.2石斑鱼肠道菌群变化分析（见图1~图4）由图1可知，对照组和试验组共有OTU为564个，试验组特有OTU为786个，对照组特有OTU为899个。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.014.F001图1添加复合芽孢杆菌后石斑鱼肠道菌群VENN由图2可知，试验组鱼肠道中厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）的丰度明显高于对照组，梭杆菌门（Fusobacteria）的丰度明显低于对照组。试验组中罗姆布茨菌属（Romboutsia）和鞘脂单胞菌属（Sphingomonas）的丰度明显高于对照组鱼；鲸杆菌属（Cetobacterium）和毛螺菌科的菌属（Lachnospiraceae_NK4A136_group）的丰度显著低于对照组。图2添加复合芽孢杆菌对石斑鱼肠道微生物组成的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.014.F2a1（a）门分类水平物种丰度前10的肠道细菌10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.014.F2a2（b）属分类水平物种丰度前10的肠道细菌由图3可知，试验组和对照组的芽孢杆菌丰度有显著性差异，试验组芽孢杆菌所占比例为44%，对照组芽孢杆菌所占比例只有3%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.014.F003图3添加复合芽孢杆菌后芽孢杆菌纲的物种组成采用LefSe分析可以找对样本划分产生显著性差异影响的微生物群或物种，通常以线性判别分析（LDA）的分值来估算某种微生物群或物种丰度对差异效果影响的大小，并把LDA≥2作为判断依据。由图4可知，试验组中有16个起重要作用的菌属，其中LDA得分前三的分别为小梨形菌科（Pirellulaceae）的Pir4_lineage菌属、克里斯滕森菌科（Christensenellaceae）的Christensenellaceae_R_7_group菌属和亚硝化单胞菌科（Nitrosomonadaceae）的MND1菌属；对照组有2个起重要作用的菌属，分别为Corynebacterium glutamicum和Photobacterium aphoticum。图4肠道菌群LEfSe分析10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.014.F4a1（a）LDA得分10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.014.F4a2（b）系统发育关系的进化分支3讨论3.1复合芽孢杆菌对石斑鱼生长的影响芽孢杆菌属作为益生菌添加至鱼饲料中可提高鱼类的生长性能[20-21]。Gobi等[11]在饲料中添加1×105 CFU/mL的地衣芽孢杆菌（B. licheniformis Dahb1）投喂越南巴沙鱼（P. hypophthalmus），24 d后试验组鱼的体质量明显高于对照组。Zhang等[22]在饲料中添加1×109 CFU/g的贝莱斯芽孢杆菌（B. velezensis LF01）投喂尼罗罗非鱼（O.niloticus），63 d后罗非鱼的体增重、脾脏指数和特定生长率均明显高于对照组。Adorian等[23]在饲料中添加1×106 CFU/g的芽孢杆菌（B. licheniformis和B. subtilis）进行56 d的饲喂试验，结果表明，试验组亚洲海鲈鱼（Lates calcarifer）体长、体质量、增重率和特定生长率均明显提高，饵料系数明显降低。本研究中，饲喂28 d的复合芽孢杆菌，试验组鱼的体增重、特定生长率均明显高于对照组，饵料系数明显低于对照组。3.2复合芽孢杆菌对石斑鱼免疫相关酶活性的影响益生菌对鱼类的免疫功能有明显影响[24]。研究表明，ACP、AKP、SOD、LZM和补体C3是鱼类免疫防御体系及代谢体系中的重要酶，是评价鱼体免疫状态及健康状况的重要指标[25]。ACP和AKP是鱼类免疫系统中非常重要的水解酶，也是重要的代谢调控酶，能够保护机体防御病原体入侵，参与细胞中生物大分子的消化，维持细胞正常代谢活动[26]。SOD是重要的抗氧化酶，能够有效清除机体内的氧自由基，提升吞噬细胞的防御能力[27]。LZM是吞噬细胞杀菌的物质基础，在机体抗炎、修复和再生过程中具有重要作用[28]。补体是鱼类免疫系统的重要组成，补体C3是补体中最重要的组成部分，能够保护机体免受外来病原体的入侵[29]。目前，关于添加芽孢杆菌对ACP和AKP活性影响的研究较多，在对凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）[30]、杂交石斑鱼（Epinephelus lanceolatus♂×E. fuscoguttatus♀）[24]和杂交鲟（Acipenser baeri♂×A. schrenkii♀）[31]等研究中发现，饲料中添加芽孢杆菌对其ACP和AKP的活性有明显影响；在对凡纳滨对虾（L. vannamei）[32]和鲤鱼（Cyprinus carpio）[33]的研究中发现，饲料中添加芽孢杆菌能够明显提高血清中SOD、LZM和补体C3的活性。本研究结果与上述研究类似，饲喂28 d复合芽孢杆菌的石斑鱼血清中ACP、AKP、SOD、LZM和补体C3的活性均明显升高。3.3复合芽孢杆菌对石斑鱼免疫相关基因表达的影响鱼类免疫可分为特异性和非特异性免疫两大部分[34]。饲料中添加益生菌对鱼体特异性和非特异性免疫基因的表达均有明显影响。Li等[24]研究表明，饲料中添加B. velezensis K2后，石斑鱼肝中免疫球蛋白M（IgM）、抗菌肽piscidin和MyD88基因的表达水平显著上调。Wang等[35]报道，饲料中添加B. clausii DE5能够明显提高石斑鱼头肾和肠道中TLR5、IL-8、IL-1β和TGF-β1等基因的表达水平。本研究中，饲料中添加复合芽孢杆菌饲喂石斑鱼，鱼脾中IgM、MHCIa、MHCIIa和CD8a等免疫基因的表达明显上调。IgM、CD4、MHCIIa是鱼体特异性免疫的标志物[36]，TCR-β、CD8a和MHCIa等是鱼体非特异性免疫中的重要基因[37]。以上基因显著上调表达，说明饲喂复合芽孢杆菌可能促进鱼体免疫器官的生长发育，对增强体液免疫和细胞免疫起重要作用[38]。3.4复合芽孢杆菌对石斑鱼肠道菌群变化的影响鱼类肠道中存在多种多样的微生物。长期的自然进化中，宿主与这些微生物形成复杂而又稳定的共生关系。宿主为肠道菌群提供了栖息生存环境，而肠道微生物对宿主的营养、健康、免疫等方面产生不可替代的影响[39-40]。研究表明，饲料中添加芽孢杆菌对凡纳滨对虾（L. vannamei）[41]和尼罗罗非鱼（O. niloticus）[42]的肠道菌群具有调节作用。本研究中，饲喂复合芽孢杆菌明显增加石斑鱼肠道中厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）的相对丰度，明显降低梭杆菌门（Fusobacteria）的相对丰度。研究表明，添加益生菌导致石首鱼（Totoaba macdonaldi）[43]和半滑舌鳎（Paralichthys adspersus）[44]肠道中厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）的丰度增加，梭杆菌门（Fusobacteria）细菌的丰度降低[45-46]，与本试验研究结果类似。厚壁菌门的许多细菌已被证实具有转化碳水化合物的能力，有助于宿主对饲料的消化[46]。梭杆菌被认为是肠道病原菌群的重要组成部分[47]。在属水平上，饲喂复合芽孢杆菌显著提高石斑鱼肠道中罗姆布茨菌属（Romboutsia）和鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）的丰度，同时试验组还检测到对其种群划分产生显著性差异影响的克里斯滕森菌科（Christensenellaceae）的Christensenella菌属。Romboutsia菌属已经被证明可以利用不同种类简单碳水化合物合成氨基酸和维生素，促进宿主的生长[48]。Sphingomonas菌属可参与降解微囊藻毒素，提高宿主的免疫力[49]。Christensenellaceae菌科的Christensenella菌属能分泌与饲料转化效率相关的α-阿拉伯葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶和β-半乳糖苷酶，有助于宿主对饲料的消化吸收[50]；饲喂复合芽孢杆菌提高了石斑鱼肠道中芽孢杆菌属（Bacillus）的丰度。因此，试验组鱼体生长性能的提高的原因是复合芽孢杆菌有助于鱼体转化碳水化合物，使促进鱼体消化吸收的菌群丰度提高。肠道病原菌群丰度的降低能够改善石斑鱼肠道的健康状况。芽孢杆菌属丰度的增加是试验组饲喂的复合芽孢杆菌成功定植并发挥作用的表现。4结论饲喂3株从健康石斑鱼肠道分离的复合芽孢杆菌（B. aerius B18、B. aryabhattai B20、B. licheniformis B25）能够明显促进石斑鱼的生长；提高鱼血清中ACP、AKP、SOD、LZM和补体C3等重要免疫相关酶的活性，上调石斑鱼免疫组织脾中免疫基因IgM、MHCIa、MHCIIa和CD8a的表达；促进鱼体合成转化碳水化合物，提高饲料转化率，提升降解毒素的厚壁菌门（Firmicutes）、罗姆布茨菌属（Romboutsia）和鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）等菌群丰度，明显降低肠道病原菌群的梭杆菌门（Fusobacteria）的菌群丰度。