纤维素酶是降解纤维素的一类复杂酶系的总称，广泛用于制备贮存饲料[1]。有研究表明，青贮饲料中添加纤维素酶可有效降低其纤维素与半纤维素的含量，提高营养价值，与乳酸菌联用可提高乳酸水平，降低pH值，益于长期贮存[2-3]。反刍动物日粮中添加纤维素酶制剂，可破坏饲料成分的细胞壁结构，释放营养物质，提高饲料的消化率，增加动物体重[4-5]。但纤维素酶制剂成本高、产量低，阻碍纤维素酶在饲料行业的广泛应用[6-7]。纤维素是饲料的主要组成成分[8]，其降解的关键作用酶是纤维素酶，但从自然界分离所得野生菌种产酶能力弱、稳定性低，难以适应工业化生产的要求[9-10]。在微生物发酵工业中，菌种可通过人为方式施加某种诱变因素改变遗传物质，引起细胞物质代谢改变，筛选得到目的产物的高产菌株[11-12]。有研究表明，通过复合理化因素诱发突变的效果优于单因素诱变[13]。徐广伟[14]采用单因素NTG化学诱变康氏木霉，结果均为负突变；然后进行紫外照射-LiCl复合理化诱变，筛选得到一株突变株E-1，羧甲基纤维素钠（CMC）酶活增长率为350.5%，滤纸酶活（FPA）酶活增长率为87.65%。复合理化因素交替处理时，诱变剂量应适中或偏低[15]。目前，对有关拟康氏木霉的复合诱变研究较少，而且采用硫酸二乙酯（DES）作为诱变因素无相关报道。因此，本研究以拟康氏木霉（Trichoderma pseudokoningii）为出发菌株，采用常温常压等离子体（ARTP）和硫酸二乙酯（DES）复合诱变，通过刚果红染色初筛和纤维素酶活测定复筛确定突变菌株的性能，优化高产菌株产酶培养基，获得高效产酶条件，以期为纤维素酶的产业化发展提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1菌株与培养基拟康氏木霉（编号3.6612）购自中国科学院微生物研究所。PDA：20%马铃薯浸取液（市面购买新鲜马铃薯，去皮切小块取200 g，100 ℃水浴30 min，纱布过滤去除残渣，补去离子水至1 L）、葡萄糖20 g/L、琼脂20 g/L。菌体生长培养基：20%马铃薯浸取液、葡萄糖20 g/L、K2HPO4 3 g/L、MgSO4·7H2O 1.5 g/L、琼脂20 g/L，pH值6.0。羧甲基纤维素钠（CMC-Na）初筛培养基：CMC-Na 10.0 g/L、(NH4)2SO4 2.0 g/L、乳糖3 g/L、KH2PO4 1.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、琼脂20 g/L。液体产酶培养基[16]：微晶纤维素12.5 g/L、玉米浆粉12 g/L、(NH4)2SO4 2 g/L、MgSO4·7H2O 1.2 g/L、CaCl2·2H2O 1.4 g/L、Mandels微量元素营养盐1 mL/L、吐温80 2 mL/L，pH值4.8。Mandels微量元素营养盐：FeSO4 5 g/L、CoCl2 3.7 g/L、MnSO4 1.6 g/L、ZnSO4 1.4 g/L。以上培养基均121 ℃灭菌20 min。1.1.2试剂与设备刚果红染色液：配置刚果红染液1 g/L、0.22 µm滤膜过滤除菌。DNS试剂：3,5-二硝基水杨酸2.65 g、NaOH 4.95 g、去离子水390 mL；完全溶解后依次添加酒石酸钾钠76.5 g、苯酚（50 ℃融化）1.9 mL、偏重亚硫酸钠2.095 g。棕色瓶避光保存一周。MJ-54A型高压蒸汽灭菌锅（上海施都凯仪器设备有限公司）、ARTP诱变育种系统（江苏无锡源清天木生物科技有限公司）、ZWYR-D2403型恒温摇床（上海智城分析仪器制造有限公司）、多功能酶标仪（Perkin Elmer）、CD14DⅡ型台式离心机（上海天美生化仪器设备有限公司）、SHP型生化培养箱（北京中兴伟业仪器有限公司）。1.2试验方法1.2.1菌种活化与孢子培养取部分菌种孢子干粉溶解于1 mL无菌水中（甘油管保存剩余部分），适当稀释后涂布于PDA平板培养基，30 ℃培养7 d，取边长2 mm的小方块接种于菌体生长培养基，30 ℃培养15 d，15%甘油冲洗菌丝及孢子，振荡10 min，3层擦镜纸过滤，收集滤液调整孢子浓度为108 CFU/mL，-80 ℃保存。1.2.2诱变方法1.2.2.1ARTP诱变方法ARTP诱变仪提前打开紫外灯灭菌，设置输出功率110 W，照射距离为2 mm，工作气流10 L/min。在超净工作台中取出发菌株孢子悬液10 μL，均匀涂布于无菌诱变载片，放入无菌平板，转移至ARTP诱变工作室，依次放入诱变系统的载片口上，设置照射时间为0、30、50、70、90、110、130、150、180 s。照射后的载片立即放入装有1 mL无菌水的1.5 mL离心管中，振荡10 min，适当稀释涂布于菌丝生长培养基，每个时间条件设置K0平行，30 ℃培养2~3 d，记录平板中的菌落数以计算致死率。1.2.2.2DES诱变方法取灭菌的50 mL离心管，加入出发菌株孢子悬液100 μL以及9.9 mL磷酸盐缓冲液（0.1 mol/L，pH值为7.0），分别加入0、20、40、60、80、100、120 μL DES原液，使其终浓度为0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%，30 ℃恒温避光振荡20 min，加入10% Na2S2O3 500 μL振荡培养30 min，终止反应。适当稀释后涂布于菌丝生长培养基，每个浓度设置3个水平，30 ℃培养2~3 d，记录平板中的菌落数以计算致死率。1.2.2.3ARTP-DES复合诱变根据ARTP与DES诱变致死率的情况，确定复合诱变条件为ARTP照射时间为110 s，DES浓度为0.8%。超净工作台中取出发菌株孢子悬液10 μL，均匀涂布于无菌诱变载片，按照ARTP诱变方法操作设置照射时间为110 s，照射结束后将诱变载片放入10 mL离心管，加2 mL生理盐水，30 ℃恒温孵化30 min。孵化后加入装有8 mL磷酸盐缓冲液（0.1 mol/L，pH值为7.0）的50 mL离心管混匀，配制10 mL反应体系，无菌条件下加入80 μL DES原液，避光30 ℃恒温振荡20 min，结束后加入10% Na2S2O3 500 μL继续振荡培养30 min，终止反应，涂布于菌丝生长培养基，30 ℃培养2~3 d，挑取生长旺盛的菌落转接于菌丝生长培养基纯化培养以备后续筛选。1.2.3突变菌株初筛方法[17]取复合诱变挑选的菌落边长2 mm的小方块转接至初筛培养基，30 ℃培养24~36 h，向平板加入5 mL无菌的刚果红染液，染色1 h后弃染液，接着向平板中加入少量去离子水冲洗掉染液，接着向平板中加入少量1 mol/L的NaCl溶液洗脱，30 min后倒掉洗脱液，测定透明圈直径（D）和菌落的直径（d），并计算其比值（D/d）。1.2.4突变菌株复筛方法1.2.4.1摇瓶复筛[16]将透明圈/菌落直径的比值较大的菌株做产孢培养，制备孢子悬液，调整孢子悬液浓度为108 CFU/mL，以1%的接种量加入液体产酶培养基，30 ℃、200 r/min培养7 d，自接入起，每24 h取样检测酶活性。1.2.4.2葡萄糖标准曲线的制作[18]称取少量葡萄糖置于烘箱中，100 ℃干燥3 h后准确称取0.200 g，加去离子水定容至100 mL，葡萄糖浓度为2 g/L。分别取此溶液0、0.15、0.3、0.45、0.6、0.75 mL，加入柠檬酸缓冲液（50 mmol/L，pH值为4.8）定容至2 mL，加入2 mL DNS溶液，沸水浴10 min，迅速冷却后定容至25 mL，采用酶标仪测定OD540 nm。1.2.4.3粗酶液的制备取3 mL发酵液至离心管，8 000 r/min离心10 min，上清液即为粗酶液。1.2.4.4酶活测定[19]滤纸酶活的测定：将定性滤纸裁剪成1 cm×6 cm（50 mg）大小的滤纸条，放入10 mL离心管，依次加入1.5 mL柠檬酸缓冲液（50 mmol/L，pH值为4.8）和500 μL适当稀释的粗酶液。对照组加入500 μL柠檬酸缓冲液，50 ℃恒温水浴反应30 min，其间每5 min振荡1次，反应结束后立即加入2 mL DNS溶液，沸水浴10 min，迅速冷却后定容至25 mL，用酶标仪测定吸光值，测定波长为540 nm。外切酶活的测定：采用50 mg脱脂棉作为反应底物，代替滤纸酶活中的滤纸条，其余操作一致。内切酶活的测定：以CMC-Na为反应底物，称取0.5 g CMC-Na，采用柠檬酸缓冲液（50 mmol/L，pH值为4.8）定容到100 mL，即得0.5% CMC-Na溶液，取1.5 mL 0.5% CMC-Na溶液代替1.5 mL柠檬酸缓冲液，其余操作一致。纤维素酶活单位（IU/mL）定义：在50 ℃、pH值为4.8条件下，每毫升酶液1 min内分解底物产生1 μmol葡萄糖所需的酶量。1.2.5高产纤维素酶突变菌株产酶培养优化1.2.5.1单因素试验以基础培养基为基准，依次对微晶纤维素（0.50%、0.75%、1.00%、1.25%、1.50%）、玉米浆粉（0.8%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6%）、(NH4)2SO4（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%）进行单因素试验，保持其他条件恒定，按1%的含量接种高产纤维素酶突变菌株孢子悬液，30 ℃、200 r/min培养4 d，测定纤维素酶活，初步确定最佳产酶条件。1.2.5.2正交试验根据单因素试验的结果，设置3因素3水平的正交试验，即采用L9(34)正交试验，对菌株AD-55的产酶条件进一步优化。1.3高产纤维素酶菌株的遗传稳定性检测将高产纤维素酶菌株连续培养7代，分别制得孢子悬液，按1%含量接种于液体产酶培养基，30℃、200 r/min培养4 d，测定其滤纸酶活、外切酶活、内切酶活。1.4数据统计与分析试验数据采用Excel 2019软件进行初步整理，采用SPSS 25软件进行单因素方差分析，采用Tukey's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示。2结果与分析2.1拟康氏木霉复合诱变条件确定（见图1、图2）由图1可知，拟康氏木霉ARTP致死率随照射时间的增加而增加，照射时间为110 s时致死率为81.5%，照射130 s时致死率为90.7%，照射180 s时可全部致死。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.020.F001图1拟康氏木霉ARTP诱变致死率曲线由图2可知，拟康氏木霉DES诱变致死率随DES浓度的增加而增加，DES浓度为0.8%时致死率为76.1%，DES浓度为1.2%时致死率高为95.6%。单因素诱变时选取致死率为90%~95%的诱变剂量为最佳。但本研究采用复合因素诱变。复合诱变时诱变剂量应适中或偏低，因此本研究确定ARTP照射时间为110 s，DES浓度为0.8%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.020.F002图2拟康氏木霉DES诱变致死率曲线2.2突变菌株初筛结果（见表1）菌株孢子悬液经ARTP-DES复合诱变，在平板中挑选74株生长旺盛的菌株纯化培养并编号，接入初筛平板进行刚果红染色反应。由表1可知，经过观察与测量有19株突变株透明圈与菌落直径的比值大于出发菌株，出发菌株的D/d值为1.79，AD-58的D/d值最大，为2.38。初筛结果在一定程度上可以表明纤维素酶活性的高低，但尚不能作为唯一标准，仍需进一步测定纤维素酶活性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.020.T001表119株产纤维素酶突变菌株的透明圈大小菌株透明圈直径/cm菌落直径/cm比值TP3.41.91.79AD-53.51.72.06AD-63.21.52.13AD-104.12.21.86AD-204.22.31.83AD-273.41.52.27AD-293.71.82.06AD-314.22.21.91AD-353.31.62.06AD-403.31.42.36AD-414.62.12.19AD-443.92.01.95AD-553.31.42.36AD-563.51.52.33AD-583.81.62.38AD-614.02.11.90AD-664.12.02.05AD-673.31.62.06AD-683.61.91.89AD-713.51.81.942.3突变菌株复筛结果2.3.1葡萄糖标准曲线（见图3）以葡萄糖含量为横坐标，OD540 nm为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线。标准曲线方程为：y=0.467x+0.032 7，相关系数R²=0.999 2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.020.F003图3葡萄糖含量标准曲线2.3.2酶活测定结果（见图4~图6）由图4可知，连续培养的7 d内，所有菌株的滤纸酶活均呈现先增大后减小的趋势。出发菌株在第4 d达到最大滤纸酶活，为0.75 IU/mL；AD-6、AD-55、AD-56也在第4 d达到最大滤纸酶活，分别为2.28、2.16、2.00 IU/mL，分别较出发菌株提高204.0%、188.0%、166.7%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.020.F004图4不同菌株的滤纸酶活性由图5可知，连续培养的7 d内，所有菌株的内切酶活均呈现先增大后减小的趋势。出发菌株TP在第4 d达到最大内切酶活，为1.46 IU/mL；AD-55和AD-56在第4 d达到最大内切酶活，分别为3.98、2.33 IU/mL，分别较出发菌株提高172.6%、59.6%；AD-6在第5 d达到最大内切酶活，为2.82 IU/mL，较出发菌株提高93.2%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.020.F005图5不同菌株的内切酶活性由图6可知，连续培养7 d内，所有菌株外切酶活均呈现先增大后减小的趋势。出发菌株TP在第5 d达到最大外切酶活，为2.96 IU/mL；AD-56在第4 d达到最大外切酶活，为4.41 IU/mL，较出发菌株提高49.0%；AD-6和AD-55在第5 d达到最大外切酶活，分别为5.09、7.04 IU/mL，分别较出发菌株提高72.0%、137.8%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.020.F006图6不同菌株的外切酶活性19株突变株中滤纸酶活最大的为AD-6，其次是AD-55；外切酶活与内切酶活最大的均为AD-55。综合考虑选用AD-55为产酶培养基优化的高产菌株，其滤纸酶活、内切酶活、外切酶活较出发菌株均有较大提升。2.4单因素试验优化结果（见图7~图9）碳源、氮源的含量是主要影响微生物生长代谢的因素。本试验考察碳源微晶纤维素、有机氮源玉米浆粉、无机氮源(NH4)2SO4的含量对高产突变菌株AD-55生长代谢的影响。由图7可知，1.25%微晶纤维素含量时，菌株AD-55滤纸酶活和外切酶活均最高；1%微晶纤维素含量时，菌株AD-55内切酶活最高。综合考虑，选用微晶纤维素含量1.25%进行后续试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.020.F007图7不同含量微晶纤维素对菌株AD-55纤维素酶活性影响微晶纤维素含量1.25%条件下，分别设置有机氮源玉米浆粉含量为0.80%、1.00%、1.20%、1.40%、1.60%，接入AD-55孢子悬液培养4 d后，测定纤维素酶活。由图8可知，玉米浆粉含量为1.00%时，菌株AD-55滤纸酶活、外切酶活、内切酶活已达到最大，后续增加玉米浆粉含量酶活均无太大变化。因此，选用玉米浆粉含量为1%进行后续试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.020.F008图8不同含量玉米浆粉对菌株AD-55纤维素酶活性影响微晶纤维素含量1.25%，玉米浆粉含量为1.00%条件下，分别设置无机氮源(NH4)2SO4含量为0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%，接入AD-55孢子悬液培养4 d，测定纤维素酶活。由图9可知，在(NH4)2SO4含量为0.20%时菌株AD-55滤纸酶活、外切酶活、内切酶活均达到最大值，分别为2.75、8.30、4.80 IU/mL。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.020.F009图9不同含量（NH4）2SO4对菌株AD-55纤维素酶活性影响2.5正交试验通过单因素试验初步确定了菌株AD-55最佳产酶培养基条件为微晶纤维素1.25%、玉米浆粉1.00%、(NH4)2SO4 0.20%。根据单因素试验结果设计正交试验，L9(34)正交试验因素水平见表2。每个试验3个平行，正交试验结果见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.020.T002表2L9（34）正交试验因素水平水平A微晶纤维素/%B玉米浆粉/%C (NH4)2SO4/%11.000.800.1521.251.000.2031.501.200.2510.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.020.T003表3正交试验结果与分析项目ABC滤纸酶活/(IU/mL)外切酶活/(IU/mL)内切酶活/(IU/mL)11232.357.054.3121112.247.414.4631322.527.845.0742132.487.584.6252222.828.164.9562312.738.474.7273122.217.654.6383332.647.954.8593212.528.364.76滤纸酶活k12.3702.3102.497k22.6772.5632.517k32.4572.6302.490R0.3070.3200.027外切酶活k17.4337.5478.080k28.0707.8577.883k37.9878.0877.527R0.6370.5400.553内切酶活k14.6134.5704.647k24.7634.6934.883k34.7474.8804.593R0.1500.3100.290最佳方案A2B3C2由表3可知，当以滤纸酶活为评价指标时，各因素影响的主次顺序依次为玉米浆粉、微晶纤维素、(NH4)2SO4，得到最佳产酶条件为A2B3C2。当以外切酶活为评价指标时，各因素影响的主次顺序依次为微晶纤维素、(NH4)2SO4、玉米浆粉，得到最佳产酶条件为A2B3C1。当以内切酶活为评价指标时，各因素影响的主次顺序依次为玉米浆粉、(NH4)2SO4、微晶纤维素，得到最佳产酶条件为A2B3C2。纤维素的降解依靠多种酶协同降解，产酶条件为A2B3C2时，滤纸酶活和内切酶活均最佳，因此选择此条件为最佳产酶条件，即微晶纤维素1.25%、玉米浆粉1.20%、(NH4)2SO4 0.20%。在此条件下进行验证试验，菌株AD-55的滤纸酶活性、外切酶活性、内切酶活性分别为2.89、8.82、5.10 IU/mL，均高于单因素试验优化的结果。2.6高产纤维素酶菌株遗传稳定性检测结果（见表4）由表4可知，对滤纸酶活的7组数据进行单样本T检验，得到P=0.492，表明数据均值与检验值2.89无差异。对外切酶活的7组数据进行单样本T检验，得到P=0.676，表明数据均值与检验值8.82无差异。对外切酶活的7组数据进行单样本T检验，得到P=0.277，表明数据均值与检验值5.10无差异。研究表明，菌株AD-55的遗传稳定。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.020.T004表4菌株AD-55的遗传稳定性传代数滤纸酶活性外切酶活性内切酶活性12.89±0.238.82±0.225.10±0.3222.82±0.218.68±0.595.13±0.2132.91±0.138.74±0.185.04±0.4042.78±0.199.04±0.384.92±0.0552.89±0.368.46±0.255.07±0.2062.95±0.328.68±0.635.15±0.0972.88±0.189.07±0.225.05±0.17IU/mL3讨论本研究采用拟康氏木霉为出发菌株，采用常温常压等离子体（ARTP）与硫酸二乙酯（DES）复合理化诱变，确定ARTP照射时间为110 s，DES浓度为0.8%；通过刚果红染色法初筛，得到19株透明圈直径与菌落直径比值较出发菌株大的突变菌株。其中菌株AD-58的比值最大，达到2.38。但在后续酶活测定中，AD-58的纤维素酶活并无较大提升，说明透明圈直径与菌落直径比值并不能说明菌株产酶能力的大小，需要进一步酶活测定，与邵帅等[20]研究一致。测定19株突变株酶活，滤纸酶活最大的是AD-6，其次是AD-55，外切酶活与内切酶活最大的均是AD-55，表明同一菌株产不同酶的能力大小不同，应综合考虑选用综合酶活性较大的菌株。在后续降解纤维素过程中，不同酶的协调配合，才能达到相应的效果。单因素和正交试验优化产酶条件中，培养基成分比例的不同，对微生物生长代谢有较大的影响，进而影响其单一酶的活性，与魏姣等[21]研究一致。后续若只对单一酶活性有较大需求，可针对单一酶进行优化。目前，我国虽然针对纤维素酶产菌开展了大量研究，但其酶活力低一直是制约纤维素酶产业发展的关键因素，关于纤维素酶的研究仍需进一步探索。4结论本研究通过ARTP-DES复合诱变，经刚果红染色初筛、酶活测定复筛得到一株高产纤维素酶突变菌株AD-55。通过单因素和正交试验确定其最佳产酶条件为微晶纤维素1.25%、玉米浆粉1.20%、(NH4)2SO4 0.20%。在此条件下，菌株AD-55的滤纸酶活性、外切酶活性、内切酶活性分别为2.89、8.82、5.10 IU/mL，为纤维素酶产业化奠定基础。