氨基酸是家禽生长发育必需营养物质，其中精氨酸（Arginine，Arg）在体内发挥重要的代谢与调节作用。家禽体内无法合成生长所需的Arg，只能通过日粮供给[1]。由于Arg成本较高且容易与日粮中其他营养物质发生拮抗作用，因此不宜直接加入日粮中。N-氨甲酰谷氨酸（N-carbamylglutamic，NCG）作为Arg内源合成的激活剂，可促进机体Arg内源合成，满足动物生长发育对Arg的正常需求。赵宏丽等[2]研究表明，断奶羔羊日粮中添加NCG可显著提高肠道上皮细胞分泌的免疫球蛋白A（SIgA）与白细胞介素-2（IL-2）的含量，能够保证幼龄羔羊小肠结构和功能的完整性，缓解羔羊的断奶应激，促进生长发育。王春平等[3]研究发现，在日粮中添加0.12%水平的NCG可显著提高肉鸡各个生长阶段的平均日增重，提高血清中总蛋白的含量和胸肌率。微生物大量存在于动物肠道中，在动物机体的生长发育、免疫以及代谢过程中具有重要作用[4]。王庆争[5]研究发现，N-氨甲酰谷氨酸能够提高幼兔生长发育的水平，促进幼兔肠道黏膜发育和修复，提高肠黏膜紧密连接蛋白和IL-2基因的表达水平，改善盲肠菌群的区系结构。N-氨甲酰谷氨酸可以有效缓解疾病应激对幼兔造成的生长缓慢及肠道损伤。周笑犁等[6]研究发现，日粮中添加0.1% NCG有助于提高断奶环江香猪肠道内容物中有益菌的数量、抑制有害菌的繁殖，从而改善肠道微生物区系。Zhang等[7]研究发现，饮食中补充Arg或NCG可增强十二指肠屏障功能和线粒体功能，减轻十二指肠炎症，并抑制患有IUGR的羔羊的线粒体吞噬。Zhang等[8]研究发现，日粮添加NCG对大肠杆菌激发仔猪的肠道黏膜免疫具有益作用，NCG可减少新生仔猪的腹泻。本研究在日粮中添加0.08%、0.12%、0.16%水平的NCG，研究其对庄河大骨鸡育成期公鸡肠道形态以及微生物区系的影响，为NCG应用于种公鸡生产提供参考。1材料与方法1.1试验设计144只11周龄庄河大骨鸡，随机分为4组（C组即对照组：基础日粮；N1组：基础日粮+0.08%水平NCG；N2组：基础日粮+0.12%水平NCG；N3组：基础日粮+0.16%水平NCG），每组3个重复，每个重复12只鸡。饲养采用定量采食、自由饮水、常规免疫。试验所使用的NCG纯品由安徽普盛药业有限公司提供。预试期1 w，正式试验期4 w。基础日粮组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.012.T001表1基础日粮组成及营养水平（风干基础）原料组成含量/%营养水平合计100.00玉米63.82代谢能/(MJ/kg)11.09小麦麸8.00粗蛋白/%15.50大豆粕16.00钙/%0.75玉米酒糟粕8.00可利用磷/%0.34磷酸氢钙1.20赖氨酸/%0.80石粉1.20蛋氨酸/%0.25食盐0.25蛋氨酸+胱氨酸/%0.61小苏打0.20色氨酸/%0.16预混料1.00粗纤维/%3.53蛋氨酸0.09脂肪/%3.95赖氨酸0.22灰分/%6.11色氨酸0.02注：1.预混料为每千克日粮提供：铁80 mg、铜8 mg、锰100 mg、锌80 mg、碘0.7 mg、硒0.3 mg、VA 6 500 IU、VD 850 IU、VE 12.5 mg、VK 0.85 mg、VB1 0.7 mg、VB2 4.5 mg、泛酸9.2 mg、烟酸28 mg、VB6 2.8 mg、生物素0.14 mg、叶酸0.6 mg、VB12 0.012 mg、胆碱950 mg。2.营养水平值均为计算值。1.2样本采集公鸡16周龄末，每组随机选取3只鸡，屠宰后分别从肌胃处和泄殖腔处将整段肠道剪离，取盲肠内容物置于冻存管中，液氮保存，用于16S rRNA测序；冲洗干净肠道内容物，逐一分离各个肠段（小肠：十二指肠、空肠、回肠；大肠：盲肠）。取各肠道中部1 cm左右肠段，福尔马林溶液保存，用于后续组织切片的制作，测量各肠段的绒毛高度（V）、隐窝深度（C）等。1.3肠道组织切片制作将固定完成的肠道组织修成切面整齐，厚度约1.5~2 mm的组织块，冲洗除去甲醛；梯度乙醇溶液中脱水，二甲苯透明，石蜡包埋切片（厚度5 μm），0 ℃温水中展开，贴附于载玻片，56 ℃烘干；经苏木精-伊红染色法（H.E）染色，显微镜检测分析。1.4测定指标及方法1.4.1肠道形态采用显微镜（OLYMPUS BX-53）40倍镜观察切片，计算机成像实时观察并测量小肠（十二指肠、空肠、回肠）的绒毛长度、隐窝深度以及肌层厚度，测量盲肠的肌层厚度以及肠腺细胞高度。测量时，在每个视野中随机取3处测量，取平均值。绒毛长度：肠绒毛顶端至隐窝开口处的垂直距离。小肠隐窝深度：绒毛开口的基部到黏膜肌层的垂直距离。肌层厚度：黏膜上皮至肌层的垂直距离。盲肠肠腺细胞高度：盲肠内壁肠腺细胞的垂直厚度。1.4.216S rRNA对大骨鸡盲肠微生物多样性的分析微生物样品提取总基因组DNA后，经1%琼脂糖凝胶电泳进行纯度、浓度检测并合格。对V3-V4可变区进行PCR反应，引物为F：5'ACTCCTACGGGAGGCAGCAG3'，R：5'GGACTACHVGGGTWTCTAAT3'。样品经95 ℃、3 min预变性；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，进行30个循环扩增；72 ℃延伸10 min。Illumina Hiseq 2500测序质检合格的文库，由上海美吉生物医药科技有限公司协助完成。原始序列经质控、拼接及OTU聚类后，进行物种分类注释[9-13]。1.5数据统计与分析采用SPSS 23.0软件进行单因素方差分析，采用Dunnett法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1日粮中添加不同水平NCG对育成期大骨鸡公鸡小肠形态发育的影响（见表2）由表2可知，与C组相比，N1组大骨鸡十二指肠绒毛高度、V/C值均显著升高（P0.05），空肠、回肠的绒毛高度显著降低（P0.05）；N2组大骨鸡空肠、回肠的V/C显著升高（P0.05）；N3组大骨鸡回肠的V/C和肌层厚度显著升高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.012.T002表2日粮中添加不同水平NCG对大骨鸡公鸡育成期小肠形态发育的影响组别项目十二指肠空肠回肠C组绒毛高度/μm1 027.20±110.61bc1 485.40±152.60ab1 068.80±129.15b隐窝深度/μm275.30±40.75ab167.40±41.23ab156.30±21.16aV/C3.80±0.64bc9.48±3.09bc6.97±1.50b肌层厚度/μm213.82±33.57129.25±21.78b186.57±48.20bN1组绒毛高度/μm1 244.40±132.05a1 237.80±277.16c865.80±79.47c隐窝深度/μm233.30±25.02b153.80±28.47b136.10±25.92aV/C5.37±0.71a8.36±2.73c6.59±1.61b肌层厚度/μm213.68±37.24163.84±25.62a175.55±21.73bN2组绒毛高度/μm1 146.60±56.40ab1 689.00±116.37a1 231.90±104.33a隐窝深度/μm262.20±30.71ab142.40±20.29b96.50±16.98bV/C4.40±0.34b12.10±2.21a13.32±4.02a肌层厚度/μm235.67±60.23132.14±14.21b194.74±39.84bN3组绒毛高度/μm1 004.10±92.54c1 460.00±232.42bc1 056.10±107.46b隐窝深度/μm306.00±58.70a196.50±15.23a96.50±16.89bV/C3.40±0.57c7.29±0.57c11.40±3.40a肌层厚度/μm212.05±18.08145.79±18.48ab256.32±45.86a注：同列同项目数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.2日粮中添加不同水平NCG对育成期大骨鸡公鸡盲肠形态发育的影响（见表3）由表3可知，与C组相比，N1、N2、N3组大骨鸡的盲肠肌层厚度均显著升高（P0.05），其中N2组大骨鸡厚度最高；N1、N2组大骨鸡盲肠肠腺细胞的高度均显著提高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.012.T003表3日粮中添加不同水平NCG对大骨鸡公鸡育成期盲肠形态发育的影响组别肌层厚度肠腺细胞高度C组274.24±31.06c259.64±33.23cN1组423.73±49.16b311.02±35.00bN2组620.90±66.32a363.75±45.34aN3组463.17±71.67b282.64±29.88bcμm2.3日粮中添加不同水平NCG对育成期大骨鸡公鸡盲肠微生物区系的影响十二指肠是小肠消化吸收的重要部位。基于肠道形态检测结果（十二指肠绒毛高度、V/C值），N1组均显著高于C组（P0.05）。因此，确定以N1组为研究对象（以下称为N组），进行盲肠微生物组学分析。2.3.1日粮中添加不同水平NCG对育成期大骨鸡公鸡盲肠微生物多样性的影响（见图1、表4）对NCG添加组（N组）及对照组共6个样品进行测序，经过数据的拆分、拼接、过滤和去嵌合体等一系列处理后共得到有效序列383 197条，平均每个样品的有效序列数为63 866条，碱基数为158 618 683个，有效序列的平均长度为413.8 bp。由图1可知，在97%的相似水平下，绘制不同处理组的细菌群落在OTU水平的Venn图。在6个样品中共检测到566个细菌OTU，其中N组506个，C组495个，N组特有OTU 71个，C组特有OTU 60个。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.012.F001图1不同处理组样品维恩图由表4可知，N组与对照组公鸡盲肠内容物细菌在整体结构上的丰富度和多样性均差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.012.T004表4Alpha多样性指数比较项目Shannon指数Ace指数C组平均值3.725 50426.920 0标准差0.215 3536.978 0N组平均值3.525 30414.910 0标准差0.238 3028.725 0P值0.340 900.679 8Q值0.679 800.679 82.3.2日粮中添加不同水平NCG对育成期大骨鸡公鸡盲肠微生物组成的影响（见图2、图3）由图2可知，在门水平上进行细菌群落分析，组内样本计算均值，2组样品的有效序列分配至4个属。两组中厚壁菌门（Firmicutes）相对丰度均高于50%，为第一优势菌门；拟杆菌门（Bacteroidetes）为第二优势菌门，两组中的相对丰度分别为45.2%和38.4%；放线菌门（Actinobacteria）在C组中相对丰度较高，为7.4%，但在N组中仅占1.7%；两组中变形菌门（Proteobacteria）的相对丰度极少。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.012.F002图2门水平上的细菌群落分析由图3可知，在属水平上进行细菌群落分析，两组样品中排名前三的优势菌属均为阿里氏菌属（Alistipes）、法氏杆菌属（Faecalibacterium）、巴氏杆菌属（Barnesiella）。N组中阿里氏菌属和法氏杆菌属的相对丰度高于C组，N组中梭状芽孢杆菌（Clostridia）和拟杆菌属（Bacteroides）的分布比例也高于C组；N组中瘤胃球菌属（Ruminococcus）和双歧杆菌属（Bifidobacterium）的丰度低于C组；而理研菌科中的一个菌属（Rikenellaceae）在N组中的比例达4.8%，但在C组中却几乎未检测到这种菌。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.012.F003图3属水平上的细菌群落分析2.3.3PICRUSt功能预测分析（见表5、图4）由表5可知，使用PICRUSt软件对大骨鸡盲肠内容物样品中的细菌16S rRNA测序数据进行功能预测分析，由肠道菌群的功能基因和KEEG代谢通路统计可知，C组中肠道细菌编码的基因与其功能的关系最为密切。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.012.T005表5KEGG代谢通路统计组别细胞过程环境信息处理遗传信息处理人类疾病代谢生物系统无C组63921737929475549323191400130761251888113792621N组5170022816833421338713881198187751481502892004条由图4可知，“碳水化合物的运输和代谢”类群是所有蛋白丰度最高的类群，除N组“染色质的结构和动力学”和“细胞外结构”类群的丰度略高于C组外，其他功能类群的相对丰度均低于C组。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.012.F004图4COG功能分类图3讨论3.1NCG对育成期大骨鸡公鸡小肠形态发育的影响绒毛高度、隐窝深度及其比值是肠道形态学检测的重要参数，通常被认为是禽类肠道内环境健康与否最直接的判定标准。小肠可以消化吸收各种来源的营养物质，也可以吸收各类矿物质盐。小肠对营养物质的吸收能力取决于肠上皮细胞的数量，而肠上皮细胞的数量与小肠的绒毛高度及表面积具有相关性。肠上皮细胞来源于隐窝，沿绒毛表面向上移动至绒毛尖端，因此较长和较宽的绒毛对激活细胞的有丝分裂具有积极影响，较短的小肠绒毛则可削弱肠道吸收，减弱动物的吸收能力[14]，影响动物的生长发育。隐窝深度与增强组织快速周转和对维持肠道的高能量需求有关，隐窝深度反映细胞生成率，隐窝变浅表明小肠上皮细胞的成熟率上升，小肠吸收功能增强[15]。因此，V/C值反映小肠吸收功能和黏膜的损伤情况[16]。本试验结果表明，添加0.08%~0.12%水平的NCG可有效提高育成期公鸡十二指肠、空肠、回肠的绒毛高度，有效降低十二指肠、空肠、回肠的隐窝深度，增大小肠V/C值，有效提高盲肠肠道肌层厚度及肠腺细胞高度，促进大骨鸡公鸡育成期的肠道发育。3.2NCG对育成期大骨鸡公鸡盲肠微生物区系的影响本研究基于16S rRNA，对大骨鸡盲肠内容物共6个样本中的微生物群落进行分析，共得到有效序列383 197条。在97%相似水平下对样品进行OTU水平分类。通过Venn图可知，日粮添加NCG后，与对照组相比，OTU存在差异，表明NCG对大骨鸡盲肠菌群结构具有一定的影响。本研究检测出的优势菌门是厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和放线菌门（Actinobacteria），与前人的研究结论基本一致[17]。本研究中，厚壁菌门占据各组细菌群落总丰度的50%以上。由两组的群落分析对比可知，日粮中添加NCG可提高大骨鸡盲肠中拟杆菌门的相对丰度，降低放线菌门的丰度。阿里氏菌属、法氏杆菌属、巴氏杆菌属为此次检测的优势菌属，且拟杆菌属在N组中所占比例高于C组，与在属水平上的群落分析结果一致。与对照组相比，分布比例升高的菌群为阿里氏菌属、法氏杆菌属、梭状芽孢杆菌属、拟杆菌属和理研菌科中的一个菌属；降低的菌属包括瘤胃球菌属和双歧杆菌属。有研究表明，阿里氏菌属在结肠炎以及各种肝和心血管纤维化疾病等疾病中起保护作用[18]。法氏杆菌属被认为是肠道中丁酸盐的生产者之一，而丁酸盐在肠道生理和宿主健康中起重要作用，是结肠细胞的主要能源，对大肠癌（CRC）和炎症性肠病具有保护作用[19]。由此可推测，日粮中添加NCG对机体的免疫功能和维持肠道正常生理健康有着积极作用。双歧杆菌通过其产生的乙酸盐参与调节肠道的防御系统，继而保护宿主免受致死性感染[20]。本研究中，NCG添加组的双歧杆菌比例略低于对照组，可能是NCG在一定程度上抑制了大骨鸡肠道内双歧杆菌的丰度，但具体原因还有待于进一步研究。4结论日粮中添加0.08%~0.12%水平的NCG对大骨鸡育成期公鸡小肠的形态发育具有一定的促进作用。日粮中添加NCG可提高肠道中拟杆菌门、拟杆菌属、阿里氏菌属的相对丰度，降低放线菌门、瘤胃球菌属、双歧杆菌属的相对丰度。