榆树（Ulmus pumila L.）主要分布于我国东北、华北地区。榆树叶具有药用价值，可安神健脾[1]。新鲜的榆树叶中含粗蛋白24%、无氮浸出物41.2%、粗脂肪2.66%、粗纤维15.2%、粗灰分4.3%[2]。榆树叶中富含胡萝卜素、矿物质，其中胡萝卜素的组分包括叶黄素和β-胡萝卜素，β-胡萝卜素含量约为142.8~364.2 μg/g干样，叶黄素含量约为880.2~1 385.4 μg/g干样。因此，榆树叶可能成为叶黄素待开发的食品新资源[3-4]。将榆树叶打浆后饲喂、青喂、风干后打成粉，并配合精饲料饲喂生猪，能够促进猪生长，预防猪维生素缺乏[5]。在小尾寒羊的日粮中添加不同比例榆树叶粉能够促进小尾寒羊生长，提高养殖效益和精饲料的转化率[6-7]。反刍动物饲料资源在畜牧生产中具有重要作用。瘤胃中存在大量微生物，微生物在反刍动物的整个消化过程中起重要作用[8]。日粮是影响瘤胃微生物和发酵最明显、最重要的因素。因此，通过调节瘤胃微生物的菌群可以提高瘤胃日粮的利用率和动物生产性能[9]。研究表明，成年反刍动物微生物菌群的结构和功能可能通过遗传性状和早期营养影响瘤胃微生物菌群[10]。本试验研究日粮中添加榆树叶对瘤胃体外产气量、体外发酵参数、氨态氮和挥发性脂肪酸的影响，旨在为反刍动物饲料资源的开发利用提供参考。1材料与方法1.1试验材料榆树叶采自内蒙古民族大学，玉米粉和玉米秸秆均为市售。瘤胃液采自3头体重相近、状况良好的西门塔尔杂交公牛。试验牛由通辽牧丰公司所提供。1.2人工瘤胃液的配制人工瘤胃营养液的组成：微量元素溶液A液：MnCl2·4H2O 10.0 g、CaCl2·2H2O 13.2 g、FeCl3·6H2O 8.0 g、CoCl2·6H2O 1.0 g、100 mL蒸馏水；缓冲溶液B液：NH4HCO3 4.0 g、NaHCO3 35.0 g、蒸馏水1 000 mL；常量元素溶液C液：KH2PO4 6.2 g、Na2HPO4 5.7 g、MgSO4·7H2O 0.6 g、蒸馏水1 000 mL；刃天青溶液：刃天青0.1 g、100 mL蒸馏水；还原剂溶液：Na2S·9H2O 625.0 mg、1 mol/L NaOH 4.0 mL、蒸馏水95 mL。营养液的组成比例：微量元素溶液A液0.1 mL、缓冲溶液B液200 mL、常量元素溶液C液200 mL、刃天青溶液1 mL、还原剂溶液40 mL、蒸馏水（H2O）400 mL。配置溶液按营养液的比例依次加入瓶中混匀，通入CO2，39 ℃水浴预热，直至混合液的颜色变为无色透明。1.3发酵液的配制人造瘤胃营养液和西门塔尔杂公牛瘤胃液按2∶1比例混合，制成体外发酵液，采集的瘤胃液采用4层纱布过滤，装入39 ℃通入CO2的容量瓶中搅拌，发酵。1.4试验设计采用单因素试验设计，分为对照组和榆树叶组。对照组的发酵底物为粉碎至40目的玉米秸秆，榆树叶组的发酵底物为粉碎至40目的榆树叶粉。准确称取约0.30 g饲料样本，加至100 mL的玻璃注射器内，39 ℃恒温干燥，每组3个重复。加入混合体外发酵液，排出玻璃注射器中的气泡，密封，记录初始刻度，39 ℃恒温水浴72 h持续培养。1.5发酵液样本采集及测定培养过程中分别读取并记录0、1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、56、64、72 h的产气量。72 h结束将玻璃注射器取出，冰水浴终止发酵，以50 mL的离心管收集发酵液，采用SX620笔式pH计测定pH值。离心发酵24 h的发酵液取2 mL上清液，加入偏磷酸溶液混匀，-20 ℃保存。采用苯酚-次氯酸钠比色法测定氨态氮（NH3-N）浓度，采用气象色谱仪测定挥发性脂肪酸（VFA）的含量[12]。1.6数据统计与分析数据采用Excel 2007软件进行整理，采用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析（One-way ANOVA），采用Tukey's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1添加榆树叶对瘤胃发酵产气量的影响（见图1、表1）由图1可知，在0~3 h起始阶段，2组间的产气量均保持上升趋势且基本一致；4 h榆树叶组的产气量显著高于对照组并持续上升（P0.05），对照组的产气量上升趋势较榆树叶组平缓；10 h榆树叶组和对照组的产气量上升趋势均有所减缓；72 h榆树叶组的产气量达到最高，对照组的产气量在56 h达到最高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.022.F001图1体外发酵72 h榆树叶组与对照组的产气量由表1可知，发酵12、24 h，榆树叶组产气量均显著高于对照组（P0.05）；发酵48、72 h，榆树叶组的产气量均极显著高于对照组（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.022.T001表1榆树叶对瘤胃发酵产气量的影响项目12 h24 h48 h72 h榆树叶组47.00±3.60a59.66±3.71a70.33±3.17A73.66±3.92A对照组28.66±3.28b38.00±4.50b42.33±3.84B41.00±2.51BSEM值3.284.503.842.51P值0.019 80.020 70.005 00.002 2t值0.661 61.051 30.963 90.960 7注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著（P0.05），不同大写字母表示差异极显著（P0.01），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。mL2.2添加榆树叶对瘤胃发酵参数的影响（见表2、表3）由表2可知，发酵72 h，榆树叶组pH值显著高于对照组（P0.05）；榆树叶组NH3-N浓度极显著高于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.022.T002表2榆树叶对发酵液的pH值和NH3-N浓度的影响项目pH值NH3-N/(mg/L)榆树叶组6.61±0.06a2.52±0.01A对照组6.25±0.08b2.17±0.12BSEM值0.080.12P值0.024 30.007 9t值-2.121 34.930 3由表3可知，发酵72 h，对照组和榆树叶组的丁酸和总挥发酸的含量无显著差异（P0.05）；与对照组相比，榆树叶组的丙酸、戊酸、异丁酸、异戊酸含量均极显著升高（P0.01），乙酸含量、乙丙比极显著降低（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.21.022.T003表3榆树叶对发酵液VFA浓度的影响项目总挥发酸/(mmol/L)乙酸/(mmol/L)丙酸/(mmol/L)异丁酸/(mmol/L)丁酸/(mmol/L)异戊酸/(mmol/L)戊酸/(mmol/L)乙丙比榆树叶组34.77±2.7963.82±0.17B19.88±0.13A1.79±0.06A9.92±0.063.19±0.08B1.39±0.06A3.21±0.02B对照组24.75±4.0069.41±0.43A15.56±0.15B1.32±0.02B10.25±0.172.61±0.07A0.83±0.02B4.46±0.07ASEM值2.795 80.179 30.136 70.066 50.063 50.087 30.064 80.023 0P值0.109 40.000 30.000 10.003 00.158 20.007 40.001 30.000 1t值2.052 0-11.920 020.691 66.439 0-1.732 85.016 67.961 4-16.906 33讨论3.1添加榆树叶对瘤胃发酵产气量的影响体外产气法是评估饲料营养价值的快速方法[11]，原理是在瘤胃微生物的作用下降解产生甲烷、二氧化碳和氢气等气体的含量和速率[13]。瘤胃液孵育底物的体外产气量可在一定程度上反映瘤胃微生物的活动趋势。因此，产气量能够反映底物发酵程度[14]。产气量还和有机物消化率及代谢能的含量有关[15]。本试验中，瘤胃发酵12、24 h时，榆树叶组的产气量显著高于对照组；发酵48、72 h时，榆树叶组的产气量极显著高于对照组，且榆树叶组的产气量在72 h时达到最高值。原因可能是榆树叶提高了瘤胃内菌群丰度，促进瘤胃内微生物生长繁殖，有助于瘤胃内环境的稳定，进而改变了瘤胃的发酵功能[16]。袁玖等[7]研究发现，采用榆树叶和精料、苜蓿的不同比例混合进行的体外产气试验，榆树叶的产气性能最好。3.2添加榆树叶对瘤胃pH值和NH3-N浓度的影响瘤胃pH值是可吸收营养成分的主要决定因素。pH值能够反映溶液中碱和酸的平衡关系[17]。pH值与炎症、腹泻和乳脂抑制有关，长时间低瘤胃pH值影响动物采食量、微生物代谢和饲料消化[18]。pH值6.0~6.4是瘤胃发酵、纤维消化和为高产动物提供适当健康状态的最佳范围[19]。本试验中，对照组与榆树叶组的瘤胃pH值均在正常值范围内，且对照组的pH值显著高于榆树叶处理组，可能是榆树叶中叶绿醇在发酵后降低了瘤胃pH值[20]，不会对瘤胃正常代谢产生不利影响。研究表明，瘤胃发酵试验中采用桑树叶与羊草组合，pH值随时间延长呈下降趋势[21]。NH3-N是瘤胃中饲料蛋白质、尿素、氨化物、肽和非蛋白氮分解的最终产物，是促进微生物蛋白质合成的原料。日粮中蛋白质含量不足，瘤胃NH3-N浓度降低，瘤胃微生物生长缓慢，阻碍碳水化合物分解利用[22]。NH3-N浓度是反映瘤胃内环境的重要指标，也是在反刍动物饲料中蛋白质和非蛋白氮在瘤胃中供应链的产物[23]。NH3-N浓度反映瘤胃肠道内营养状况，受肿瘤外流速度、肿瘤胃壁吸收、食糜排空速度和饲料蛋白溶解度等因素影响[24]。瘤胃内NH3-N浓度过低时，分解纤维素和微生物合成蛋白质的效率受到限制；NH3-N浓度过高时，可通过瘤胃壁由血液进入肝脏后合成尿素，以尿素的形式随尿排出，造成氮的浪费[25]。本试验中，榆树叶组的氨态氮浓度极显著高于对照组，表明榆树叶中可能含有较高的可溶性蛋白。研究发现，榆树叶与苜蓿和精料之间具有协同作用，能够促进瘤胃中微生物蛋白的合成，还可促进瘤胃内氮和碳的同步释放[7]。3.3添加榆树叶对发酵液VFA浓度的影响VFA是一种瘤胃内的能量来源，占瘤胃内能量需求约70%~80%。日粮变化可引起瘤胃微生物群落的变化，导致发酵模式改变，促进瘤胃VFA变化。VFA的产生受许多因素影响，包括底物组成、底物可用性、解聚速率以及存在微生物种类[26]。通过调节膳食成分可以控制VFA，因为它们可以改变发酵底物的类型[27]。瘤胃VFA含量的有利变化，对瘤胃氨消失有积极影响，对瘤胃pH值具有积极影响，同时促进新陈代谢消化，增加纤维消化率[28]。Salles等[29]研究表明，瘤胃温度高可降低总挥发性脂肪酸浓度，不影响挥发性脂肪酸的浓度。丁酸能够刺激胃上皮细胞成熟，促进营养物质吸收；丁酸过量可导致瘤胃上皮细胞过度角化，破坏屏障功能[30]。本试验中，榆树叶组总挥发酸含量与对照组差异不显著，可能是由于瘤胃内的pH值降低导致总挥发酸浓度降低[31]，也可能与反刍动物的年龄、种类或者是热应激等有关[32]。榆树叶组丁酸含量低于对照组，原因可能是瘤胃pH值小于7，丁酸被快速吸收，与卢亿等[33]研究结果一致。日粮中的精粗饲料比例是影响瘤胃发酵的重要因素之一，粗料（富含纤维性碳水化合物）利于乙酸发酵，精料（富含非纤维性碳水化合物）利于丙酸发酵。乙丙比能够反映瘤胃的发酵类型，乙酸通过三羧酸循环促进脂肪酸合成或氧化供能，是血细胞的主要能量源。丙酸的前体物质是糖异生，反刍动物体内的糖异生是肝脏组织代谢所需葡萄糖的主要来源，心脏也可利用一些丙酸[34]。丙酸发酵是动物本身和微生物能量高效率的表现[35]。瘤胃乙酸发酵有助于提高反刍动物的乳脂率，利于乳脂合成。因此，在奶牛生产中，挥发性脂肪酸中乙酸比例较高更好。瘤胃丙酸发酵有助于提高反刍动物的饲料转化率。丙酸的转化率高，产生甲烷较少。因此，在肉牛生产中，挥发性脂肪酸中丙酸比例高更好。4结论榆树叶对瘤胃发酵、产气性能、NH3-N和VFA均有促进作用，作为反刍动物饲料或饲料添加剂具有可利用的潜在价值。