益生菌具有良好的稳定性、安全性，能够在宿主体内代谢产生多种酶、有机酸、小分子物质，促进机体正常生长，成为最具潜力的替抗产品。丁酸梭菌是革兰氏阳性厌氧菌，具有耐酸耐高温的特点[1]，可以通过发酵产生丁酸、乳酸、乙酸和维生素等[2-3]。饲粮中添加丁酸梭菌可以有效提升肉鸡采食量、平均日增重[4]，降低肉鸡肠道pH值，提升空肠黏膜碱性磷酸酶活性和短链脂肪酸浓度，改善肝脏抗氧化状态，降低血清胆固醇含量和腹部脂肪比例，改善肉品质[5]。枯草芽孢杆菌是一种环境兼容性优秀的革兰氏阳性菌，可以有效提升肉鸡十二指肠、空肠、回肠绒隐比，增加空肠黏膜的超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性[6]，减轻高密度养殖下肉鸡肠道健康压力。目前，对复合益生菌与单菌种益生菌、抗生素三者在黎村黄鸡应用的研究较少。本试验在肉鸡饲粮中使用不同益生菌添加剂，研究集约化养殖条件下益生菌对黎村黄鸡生长性能、肠道形态、肠道微生物的影响，为益生菌在黎村黄鸡养殖中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料丁酸梭菌（2.88×105 CFU/g）购自湖北蓝谷中微生物技术有限公司，复合益生菌（丁酸梭菌2.56×105 CFU/g，枯草芽孢杆菌6.44×106 CFU/g）购自北京科为博生物科技有限公司。试验使用“黎村黄鸡”孵化中心孵化的鸡苗。本试验饲粮根据NRC（1994）《家禽营养标准》结合黎村黄鸡的生长周期和品种特点配制。基础饲粮组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.008.T001表1基础饲粮组成及营养水平（风干基础）原料组成含量/%营养水平合计100.0玉米68.5代谢能/(MJ/kg)12.42豆粕15.8粗蛋白/%17.20DDGS3.0粗脂肪/%4.50玉米蛋白粉2.5粗纤维/%3.00猪油1.6粗灰分/%5.00石粉1.7蛋氨酸/%0.72花生麸1.5赖氨酸/%0.60棉粕1.0食盐/%0.50棕榈粕1.0总磷/%0.60磷酸氢钙0.7钙/%1.20膨润土0.7预混料2.0注：1.预混料为每千克日粮提供：Fe 100 mg、Cu 8 mg、Mn 80 mg、I 0.5 mg、Se 0.2 mg、VA 12 000 IU、VD3 2 200 IU、VE 30 IU、VB1 2 mg、VB2 5 mg、VB6 1.5 mg、VB12 0.03 mg、叶酸1.25 mg、烟酸40 mg、D-泛酸10 mg、生物素0.36 mg。2.营养水平中代谢能为计算值，其余均为实测值。1.2试验设计及饲养管理本试验选取黎村黄鸡1 980羽，随机分为4组，每组9个重复，每个重复55只。丁酸梭菌组（A组）、复合益生菌组（B组）、对照组（C组）、抗生素（阿莫西林+恩诺沙星）处理组（D组）。试验期35 d。试验期间，试验鸡只自由饮水和采食，饲养与免疫程序均按照温泉肉鸡养殖基地饲养管理进行。1.3测定指标及方法1.3.1生长性能试验开始和结束最后1 d，每个重复随机抽取30羽称重，记录初重和末重。每天7：00开始喂料，对饲料称重计数，取平均值。巡视检查时，记录死亡与淘汰鸡。采样前空腹12 h，每个重复随机抽取6羽体况健康、体重接近平均值的鸡颈部放血，解剖。平均日采食量=(投料量-剩余料量)/试验天数(1)平均日增重=(末重-初重)/试验天数(2)1.3.2肠道形态样本采集：鸡放血后迅速解剖，截取回肠肠段中断部分1 cm肠道，生理盐水轻柔冲洗，放入充满甲醛溶液的离心管中常温保存。制作切片：24 h后将肠道从溶液中取出，选取出目标组织，利用乙醇梯度脱水，浸蜡，包埋处理，分别进行苏木精染色和伊红染色，中性树胶封片。镜检分析：采用Eclipse Ci-L拍照显微镜选取小肠组织的目的区域进行40倍成像，成像时尽量让组织充满整个视野。成像完成采用Image-Pro Plus 6.0分析软件，统一以毫米作为标准单位，分别测量每张切片中5根完整肠绒毛高度以及对应的5处隐窝深度，结果取均值。1.3.3盲肠微生物取出盲肠内容物1.5 mL放入2 mL离心管的干冰中保存。将待测样品送至上海生工生物工程有限公司进行16S高通量测序。盲肠菌群采用Chao、Ace、Simpson、Shannon多样性指数评价细菌的OTU和Alpha多样性，使用R中“correlation”package创建回肠肠道形态和菌群属水平spearman相关性分析。1.4数据统计与分析试验数据采用Excel 2013初步处理，采用Rstudio（内置R版本为3.6.1）中AOV函数进行方差分析，采用“agricolae”软件包进行图基（Tukey）诚信检验，对数据进行组间差异比较，文中图片在R语言中采用“ggplot2”包绘制。结果以“平均值±标准误”表示。P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1饲粮中添加益生菌对黎村黄鸡生长性能的影响（见表2）由表2可知，饲粮中添加丁酸梭菌对黎村黄鸡末重、平均日增重无显著影响（P0.05）。A组、B组黎村黄鸡平均日采食量显著高于D组（P0.05），A组、B组黎村黄鸡平均日采食量比C组分别提高5.9%、7.0%；A组、B组黎村黄鸡料重比显著低于C组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.008.T002表2饲粮中添加益生菌对黎村黄鸡生长性能的影响项目初重/g末重/g平均日增重/(g/d)平均日采食量/(g/d)料重比/%A组30.17782.7021.5045.40a2.12bB组30.13775.2021.2945.70a2.15bC组30.16763.7520.9642.70ab2.37aD组30.19726.6019.8940.40b2.03bSEM0.0526.953.230.580.03P值0.7580.7980.4120.0350.011注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.2饲粮中添加益生菌对黎村黄鸡肠道形态的影响（见表3）由表3可知，A组、B组黎村黄鸡绒毛高度显著高于D组（P0.05）；B组黎村黄鸡隐窝深度分别显著高于C组、D组（P0.05）；B组黎村黄鸡绒隐比显著低于C组（P0.05），而A组绒隐比与C组差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.008.T003表3饲粮中添加益生菌对黎村黄鸡肠道形态的影响组别绒毛高度/μm隐窝深度/μm绒毛高度/隐窝深度A组0.79a0.17ab4.82abB组0.70a0.18a3.85bC组0.72a0.15b5.22aD组0.57b0.14b4.10abSEM0.030.010.31P值0.0000.0020.0092.3饲粮中添加益生菌对黎村黄鸡盲肠微生物的影响2.3.1饲粮中添加益生菌对黎村黄鸡盲肠微生物α多样性的影响（见表4）由表4可知，测序样本中A组、B组、C组、D组黎村黄鸡的Coverage值均为1。B组黎村黄鸡Shannon值分别比A组、C组、D组高7.7%、4.9%、4.0%，B组黎村黄鸡Simpson指数低于其余3组，较A组、C组、D组分别降低0.04、0.02、0.02。A、B两组OTU指数、ACE指数、Chao指数均低于C组。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.008.T004表4饲粮中添加益生菌对黎村黄鸡盲肠微生物α多样性的影响组别SeqOTUShannonACEChaoSimpsonCoverageA组70 271.002 960.004.5312 084.997 349.900.081B组57 119.832 983.174.8812 203.477 446.580.041C组66 229.003 123.004.6513 101.967 698.080.061D组64 198.673 136.834.6913 461.357 770.980.061SEM—173.000.15835.99437.230.01—P值—0.8370.4550.5910.8880.431—2.3.2饲粮中添加益生菌对黎村黄鸡盲肠微生物门水平的影响（见表5、图1）由表5、图1可知，厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）是黎村黄鸡盲肠菌群中的优势细菌。A组黎村黄鸡厚壁菌门（Firmicutes）相对丰度比B组、C组、D组分别降低4.5%、4.0%、3.6%，而B组黎村黄鸡拟杆菌门（Bacteroidetes）相对丰度较A组降低5.1%，较C组降低1.6%。而变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、互养菌门（Synergistetes）相对丰度占比极小，4组之间无差异。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.008.T005表5饲粮中添加益生菌对黎村黄鸡盲肠微生物门水平的影响组别FirmicutesBacteroidetesSynergistetesActinobacteriaProteobacteria其他A组55.530 418 3141.763 141 060.817 012 7240.220 508 5111.232 341 1010.436 578 298B组60.001 548 1936.601 543 180.906 073 8230.248 190 3871.443 383 2560.799 261 159C组59.581 022 3638.281 509 940.483 999 4690.248 645 8781.186 998 1740.217 824 187D组59.138 228 8037.480 761 581.385 973 1840.329 019 7131.301 693 4530.364 323 273注：图中只显示相对丰度前5的细菌，其余均归于other。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.008.F001图1饲粮中添加益生菌对黎村黄鸡盲肠微生物门水平的影响注：图中只显示相对丰度前5的细菌，其余均归于other。2.3.3饲粮中添加益生菌对黎村黄鸡盲肠微生物属水平的影响（见图2、表6）由表6、图2可知，黎村黄鸡盲肠菌群属水平上优势菌群为另枝菌属（Alistipes）、梭菌属（Clostridium）、拟杆菌属（Bacteroides）、乳杆菌属（Lactobacillus）、瘤胃菌属（Ruminococcus2）。A组黎村黄鸡另枝菌属相对丰度比B组、C组分别提高12.2%、10.1%；B组黎村黄鸡拟杆菌属相对丰度比A组提高9.0%、比D组提高12.6%；A组、B组黎村黄鸡瘤胃菌属比C组分别提高1.3%、1.7%；B组黎村黄鸡乳杆菌属相对丰度比A组提高2.4%；而C组黎村黄鸡梭菌属比A组、B组分别提高0.40%、0.88%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.008.T006表6饲粮中添加益生菌对黎村黄鸡盲肠微生物属水平的影响项目A组B组C组D组Alistipes28.388 544 6016.142 155 2718.238 103 4429.411 155 23Bacteroides7.388 893 8216.434 940 0816.210 419 183.810 093 66Faecalibacterium4.397 502 844.317 320 188.843 133 622.442 718 25Butyricicoccus2.972 433 271.435 672 901.858 325 501.548 482 85Clostridium8.044 014 477.563 537 488.437 212 378.430 771 62Ruminococcus23.635 595 184.049 393 762.297 511 372.481 771 13Subdoligranulum1.765 669 281.953 660 251.363 508 831.879 608 39Sporobacter1.256 129 850.585 258 461.301 058 700.691 656 79Pseudoflavonifractor1.843 184 481.387 493 791.826 408 860.955 002 48Lactobacillus4.841 555 357.243 740 666.776 628 3112.946 276 35Intestinimonas1.731 443 581.848 498 591.428 739 171.864 042 64Flavonifractor1.904 007 701.907 127 901.583 147 811.614 801 61Blautia1.655 739 181.510 228 271.180 075 991.082 395 71barnesiella2.670 996 500.925 996 060.317 267 380.423 033 20Acetanaerobacterium1.725 667 691.349 519 131.138 804 330.898 162 34Unclassified19.085 305 5423.447 858 1420.684 598 3523.494 027 17注：表中只显示前15种相对丰度较大的细菌。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.008.F002图2饲粮中添加益生菌对黎村黄鸡盲肠微生物属水平的影响注：图中只显示前15种相对丰度较大的细菌。2.4饲粮中添加益生菌的黎村黄鸡回肠肠道形态与盲肠菌群相关性分析（见图3、图4）由图3可知，黎村黄鸡绒毛高度与拟杆菌门（Bacteroidetes）呈正相关（R2=0.68），与厚壁菌门（Firmicutes）呈负相关（R2=-0.57），与变形菌门（Proteobacteria）呈负相关（R2=-0.28）。隐窝深度与拟杆菌门呈正相关（R2=0.14），与厚壁菌门呈负相关（R2=-0.21），与变形菌门呈正相关（R2=0.50）。绒隐比与拟杆菌门呈正相关（R2=0.59），与厚壁菌门呈负相关（R2=-0.36），与变形菌门呈负相关（R2=-0.92)。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.008.F003图3黎村黄鸡回肠肠道形态与盲肠菌群门水平相关性注：V为绒毛高度；C为隐窝深度；V/C为绒隐比；下图同。由图4可知，黎村黄鸡绒毛高度与乳杆菌属（Lactobacillus）呈正相关（R2=0.90），与粪杆菌属（Faecalibacterium）呈正相关（R2=0.47），与拟杆菌属（Bacteroides）呈正相关（R2=0.41）。隐窝深度与乳杆菌属呈负相关（R2=-0.69），与瘤胃菌属（Ruminocollus）呈正相关（R2=0.95），与粪杆菌呈负相关（R2=-0.05），与另枝菌属（Alistipes）呈负相关（R2=-0.44）。绒隐比与粪杆菌属呈正相关（R2=0.78），与梭菌属（Clostridium）呈正相关（R2=0.56）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.008.F004图4黎村黄鸡回肠肠道形态与盲肠菌群属水平相关性3讨论3.1饲粮中添加益生菌对黎村黄鸡生长性能的影响丁酸梭菌进入动物肠道后可以产生促进营养物质吸收的多种酸酶[7]，提升动物对饲料的利用效率。本试验在饲粮中添加益生菌的试验A组、B组黎村黄鸡料重比降低，与Takahashi等[4]的观点一致，但是对改善黎村黄鸡的采食量并无明显作用。冯宇妍等[8]研究表明，肉鸡在13~21日龄阶段使用益生菌会降低其日采食量，但对平均日增重无显著影响，但有增长趋势，与本试验结果不同，可能是由于本试验使用的黄羽肉鸡品种与白羽肉鸡品种的差异所导致[9]。3.2饲粮中添加益生菌对黎村黄鸡回肠肠道形态的影响饲粮中添加丁酸梭菌可以提高肉鸡肠道绒隐比，改善生长性能，提高营养物质表观消化率，对肠道形态具有有益的影响[10]。丁酸梭菌可以有效改善肉鸡肠道发育状况，提升肠道相对长度[11]。枯草芽孢杆菌作为抗生素替代品，可以提高肉鸡肠道绒隐比，增加空肠黏膜的超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性，提升肉鸡抗氧化能力和生长性能[6]。接种了产气荚膜梭菌的肉鸡使用枯草芽孢杆菌后可以有效提升肠道绒隐比、绒毛表面积、小肠重量[12]。于洁等[13]研究发现，饲粮中添加丁酸梭菌和枯草芽孢杆菌对绒毛高度的影响无显著差异，与本文观点类似。丁酸梭菌对于产蛋鸡肠道形态也有一定影响。张金金等[14]研究发现，丁酸梭菌能够提升产蛋鸡回肠绒隐比。枯草芽孢杆菌作为饲料添加剂，可以有效提升肉鸡十二指肠、空肠、回肠绒隐比，但对总体体重、饲料消耗没无明显影响[15]。本试验中，使用益生菌并未有效改善黎村肉鸡的绒毛高度，但是复合益生菌组绒隐比低于丁酸梭菌组，可能是由于在肉鸡前期生长中多种外源菌增殖消耗大量营养物质所致。3.3饲粮中添加益生菌对黎村黄鸡盲肠菌群的影响复合益生菌添加到饲粮中可以提升黎村黄鸡35 d时盲肠菌群中变形菌门（Proteobacteria）、另枝菌属（Alistipes）、瘤胃球菌属（Ruminococcus）的相对丰度，降低厚壁菌门（Firmicutes）、乳杆菌属的相对丰度；而添加丁酸梭菌则提高了厚壁菌门、拟杆菌属（Bacteroides）相对丰度。Hong等[16]发现，肉鸡饲粮中添加芽孢杆菌和金霉素均可以有效提高厚壁菌门、拟杆菌门、瘤胃球菌属、乳杆菌属的相对丰度，与本试验结果一致。而肉鸡肠道菌群中最主要的门是厚壁菌门和拟杆菌门[17]，其次是变形菌门[18]。相关文献指出，厚壁菌门可以增强营养吸收[19]，粪肠球菌可以降解纤维素，加强碳水化合物吸收[20]。因此，在饲粮中添加益生菌影响了黎村黄鸡盲肠菌群中有益菌的相对丰度，改变了肉鸡的生长趋势。3.4饲粮中添加益生菌的黎村黄鸡回肠肠道形态与盲肠菌群相关性分析本试验通过相关性热图可知，绒隐比与拟杆菌门（Bacteroides）呈正相关（R2=0.59），与厚壁菌门呈负相关（R2=-0.36）；绒隐比与粪杆菌属呈正相关（R2=0.78），与梭菌属（Clostridium）呈正相关（R2=0.56）。微生物在胃肠道的活动是一个复杂的过程，而添加复合益生菌和丁酸梭菌对黎村黄鸡回肠肠道形态指标产生影响。随着肠道绒毛高度、隐窝深度的改变必然导致肠道对营养物质的消化吸收能力的改变[21]，而肠道菌群主要利用宿主自身营养物质来进行增殖活动，并产生有机酸为肠道上皮细胞生长供能，促进肠道发育[22]，进一步说明添加益生菌对黎村黄鸡肠道形态、肠道健康具有促进作用。4结论饲粮中添加两种益生菌均可以显著降低1~35日龄黎村黄鸡料重比，改善肠道形态，提高盲肠有益菌相对丰度，促进肠道健康。