三价铬（Cr3+）是人和动物体的必需痕量元素[1]。Cr3+作为铬调寡肽（chromodulin）的活性组成成分，可在不影响胰岛素的情况下，增强胰岛素敏感性，改变葡萄糖代谢[2-3]。有研究表明，在饲料中添加适宜水平的Cr3+可有效提高动物的生长性能和饲料利用率[4-6]，调节葡萄糖耐量，提高碳水化合物利用率[7]，增强机体免疫力[8]。Cr3+还具有良好的抗应激作用。应激状态下动物机体内葡萄糖代谢增强，体内Cr等微量元素的额外损失加大。因此，补铬可有效缓解动物由于应激引发的危害[9]。王会[10]研究发现，在饵料中添加蛋氨酸铬可有效改善热应激条件下的肉鸡免疫功能。杨游等[11]研究发现，Cr3+可通过调节奶牛内分泌、热休克蛋白70（HSP70）基因表达提高耐热性。Cr3+对水产动物的研究主要集中在生长、糖利用等方面，关于抗应激能力方面的研究较少。李洪霞[12]研究发现，饵料中添加适宜水平的Cr3+可有效改善罗非鱼的抗应激能力。研究表明，在饵料中添加Cr3+能够有效降低鲤鱼血清皮质醇含量[13-14]。温度是影响水产动物生长、繁殖的重要因素，热应激能够引起机体热休克蛋白（HSPs）的合成[15]。有研究表明，随着环境温度升高，虹鳟不同组织（脑、心脏、鳃、中肾和肌肉）中HSP90 mRNA的表达量逐步上调[16]。但有关Cr3+对鲤鱼HSP70的影响尚未见报道。因此，本试验以蛋氨酸铬作为热应激调节剂，在饵料中添加不同水平蛋氨酸铬饲喂鲤鱼，研究蛋氨酸铬对鲤的抗热应激的影响，为其在水产养殖中的合理应用提供参考。1材料与方法1.1试验动物试验鲤鱼购自天津市晨辉饲料有限公司养殖基地。试验开始前暂养2 w，期间投喂不添加Cr3+的基础饵料。CrMet购自湖北拓楚慷元医药化工有限公司，有效含量为99%，Cr3+含量为80%。1.2试验设计暂养结束选取初始体重为（40.95±4.80）g的试验鱼1 260尾，随机分配至21只蓝色塑料水箱。试验分为7组，1组为对照组，每组3个重复，每个重复投放60尾，静水养殖。试验期60 d。试验饵料以酪蛋白为蛋白源，大豆油为脂肪源，玉米淀粉为糖源，蛋氨酸铬（CrMet）为铬源，配制7种不同铬含量的纯化饵料。试验1组~7组分别在基础饵料中添加0、0.10、0.20、0.40、0.80、1.60、3.20 mg/kg蛋氨酸铬。各组饵料Cr3+水平实测值分别为0.31、0.43、0.57、0.73、1.13、1.90、3.64 mg/kg。所有原料过80目筛，经逐级放大混匀，制成2种规格（Φ=1.5 mm、Φ=3.2 mm）的颗粒饵料，40 ℃烘干2 h，自然风干，-20 °C保存。基础饵料组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.011.T001表1基础饵料组成及营养水平（风干基础）原料组成含量营养水平合计100.00酪蛋白35.00干物质91.46豆油6.00粗蛋白32.11玉米淀粉35.00粗脂肪5.73预混料1.00粗灰分2.98氯化胆碱0.20磷酸二氢钙1.80羧甲基纤维素钠2.00微晶纤维素19.00注：1.预混料为每千克饵料提供：VA 6 000 IU、VD3 2 000 IU、VE 60 mg、VK3 10 mg、VB1 9 mg、VB2 9 mg、VB6 7.5 mg、VB12 0.03 mg、VC 90 mg、D-生物素 0.15 mg、D-泛酸 30 mg、叶酸 3 mg、烟酰胺 45 mg、肌醇 80 mg、Fe 140 mg、Cu 3.5 mg、Zn 40 mg、Mg 100 mg、Co 0.25 mg、I 0.5 mg、Se 0.3 mg、Mn 15 mg、乙氧基喹啉 5 mg。2.营养水平均为实测值。%1.3饲养管理每日饱食投喂2次（7：00，16：00）。采用曝气超过24 h的自来水，每天换水约为总水量的1/3，期间水温为23~25 ℃，pH值7.6~7.8，氨氮≤0.05 mg/L，溶解氧不低于6.0 mg/L。1.4测定指标及方法1.4.1样品采集饲养结束，各组试验鲤鱼禁食24 h，采用丁香酚（1∶10 000）麻醉，每槽随机取10尾试验鱼，于冰盘上解剖取肝胰脏应用于检测肝胰脏部分生化指标，-80 ℃保存。剩余试验鱼将水温从25 ℃逐渐升温至32 ℃ 2 h，持续应激24 h。热应激试验后，在2、6、12、18、22、26 h时每组选择5尾鱼，取心脏液氮速冻，用于RNA提取。1.4.2肝胰脏免疫指标的测定丙二醛（MDA）含量、总抗氧化能力（T-AOC）以及过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、碱性磷酸酶（AKP）活性均采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定。1.4.3HSP70基因表达分析鲤鱼心脏总RNA采用RNAiso Plus试剂（TaKaRa公司）提取，采用TaKaRa PrimeScript™ RT Master Mix试剂盒，将心脏中的总RNA反转录为cDNA第一链，操作方法按照试剂盒说明书进行。采用Primer Premier 5.0软件设计引物，引物设计见表2。以β-actin作为内参基因，HSP70为目的基因，引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。荧光定量PCR采用SYBR® Premix Ex Taq™ Ⅱ试剂盒（TaKaRa公司），采用两步法测定，采用2-ΔΔCt法分析基因相对表达量[17]。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.011.T002表2引物设计引物序列（5'→3'）序列号β-actinCCGTGACATCAAGGAGAAM24113GATACCGCAAGATTCCATACHSP70AGCCTGTGGAAAAAGCCC李勇男[18]CATAAGCCACTGCCTCGTC1.5数据统计与分析采用SPSS 19.0软件对数据进行单因素方差分析（One-way ANOVA），采用Tukey's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1不同Cr3+添加水平对鲤鱼肝胰脏免疫指标的影响（见表3）由表3可知，4组、5组、6组（0.73~1.90 mg/kg Cr3+）鲤鱼肝胰脏的T-AOC和CAT活性显著高于1组（0.31 mg/kg Cr3+）（P0.05）。2组~5组（0.43~1.13 mg/kg Cr3+）鲤鱼肝胰脏MDA含量显著低于其他3组（P0.05）。7组（3.64 mg/kg Cr3+）鲤鱼肝胰脏的AKP活性显著高于1组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.011.T003表3不同Cr3+添加水平对鲤鱼肝胰脏免疫指标的影响组别T-AOC/(μmol/g prot)SOD/(U/mg prot)CAT/(U/mg prot)MDA/(μmol/g prot)AKP/(U/g prot)1组0.81±0.15c92.18±0.89b20.14±1.17c1.35±0.14a4.00±0.99b2组0.92±0.04c92.07±14.56b24.66±1.47bc0.89±0.03b5.94±0.25ab3组1.38±0.26abc127.00±13.80b27.16±0.45bc0.77±0.04b6.70±1.04ab4组1.78±0.18a134.70±25.64b31.58±2.94b0.53±0.04b6.35±1.12ab5组1.61±0.12ab132.81±22.61b39.32±4.21a0.54±0.01b4.30±0.28b6组1.84±0.17a213.05±4.81a29.77±2.24b1.55±0.27a4.18±0.38b7组1.10±0.17bc136.60±24.65b25.51±1.23bc1.43±0.16a8.52±0.91a注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）。2.2热应激后不同Cr3+添加水平对鲤心脏HSP70基因表达量的影响（见表4）由表4可知，1组、2组、6组（0.31、0.43、1.90 mg/kg Cr3+）鲤鱼HSP70表达水平均在热应激2~6 h后显著上调（P0.05），随时间的推移下降并趋于稳定。其中，1组、2组HSP70分别在22 h、18 h时显著下调（P0.05）。3组（0.57 mg/kg Cr3+）HSP70表达水平在热应激2 h时显著上调，而后趋于稳定；26 h则显著下调（P0.05）。4组、5组（0.73~1.13 mg/kg Cr3+）HSP70表达水平均在2~10 h显著上调（P0.05），而后回到0 h水平；至26 h时，4组鲤鱼的HSP70表达水平显著下调（P0.05）。7组（3.64 mg/kg Cr3+）组鲤鱼的HSP70表达水平未随时间推移出现显著变化（P0.05）。2~10 h，4组、5组（0.73 mg/kg≤Cr3+≤1.13 mg/kg）鲤鱼心脏HSP70基因表达水平均显著高于1组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.011.T004表4热应激后不同Cr3+添加水平对鲤心脏HSP70基因表达量的影响组别0 h2 h6 h10 h14 h18 h22 h26 h1组1.00±0.00cd1.30±0.05Ea1.19±0.04Cab0.83±0.02Cde0.83±0.07Bde1.04±0.0ABbc0.80±0.02Ce0.98±0.08Acd2组1.00±0.00cd1.56±0.02Da1.31±0.07Cb1.07±0.06Bc1.08±0.03Ac0.80±0.05Ce0.85±0.03BCde0.97±0.02Acd3组1.00±0.00bc1.88±0.00Ca0.90±0.02Dcd0.91±0.04Cbcd0.94±0.06ABbcd1.03±0.00ABbc1.00±0.03Abc0.81±0.04ABd4组1.00±0.00ef2.18±0.03Ba1.77±0.00Bb1.32±0.02Ac1.03±0.00ABe1.11±0.02Ad0.96±0.01ABf0.75±0.01Bg5组1.00±0.00d3.06±0.03Aa1.95±0.01Ab1.22±0.05ABc0.93±0.05ABde0.81±0.02Ce0.91±0.04ABde0.87±0.08ABde6组1.00±0.00bc2.08±0.01Ba1.93±0.08ABa1.11±0.01Bb1.07±0.09Abc0.88±0.08ABc0.89±0.02BCc0.90±0.00ABc7组1.00±0.00ab0.93±0.02Fabc0.99±0.03Dab1.10±0.05Ba1.08±0.02Aa0.81±0.09Cd0.88±0.01BCbc0.83±0.07ABbc注：同行数据肩标小写字母不同，表示Cr3+添加量相同时HSP70表达量随时间变化差异显著（P0.05）；同列数据肩标大写字母不同，表示同一时间点HSP70表达量随Cr3+添加量的变化差异显著（P0.05）。3讨论3.1不同Cr3+添加水平对鲤鱼肝胰脏免疫指标的影响有研究表明，Cr3+能够提高抗氧化酶活性，增强机体免疫力[19]。SOD、CAT是机体重要的抗氧化防御性功能因子，能够清除体内活性氧自由基；MDA含量能够反映机体受自由基攻击的程度；T-AOC反映机体防御系统抗氧化的能力，是机体抗氧化系统功能状况的综合性指标。冯彬彬等[20]研究发现，在饵料中以葡萄糖酸铬形式添加0.1~0.4 mg/kg Cr3+能够有效提高锦鲤的SOD、CAT活性，降低MDA含量，表明添加适宜水平的葡萄糖酸铬具有提高锦鲤抗氧化能力的作用。有研究表明，在饵料中添加适宜水平的吡啶羧酸铬能够增强建鲤幼鱼的免疫功能[21]。蔡海瑞等[9]在饵料中分别添加不同铬源（氯化铬、吡啶甲酸铬和蛋氨酸铬），比较不同铬源对凡纳滨对虾幼虾非特异性免疫的影响，发现蛋氨酸铬组的效果最佳。本试验前期试验中，以糊精为糖源，在饲料中添加不同水平蛋氨酸铬投喂鲤幼鱼，结果表明，在饵料中添加0.4~0.8 mg/kg蛋氨酸铬能够增强鲤鱼肝胰脏的非特异性免疫力[22]，上述试验结果与本试验结果一致。饵料中添加适量蛋氨酸铬能够显著提高试验鱼肝胰脏T-AOC和CAT活性，降低MDA含量，说明蛋氨酸铬能够提高鲤鱼的抗氧化能力。3.2热应激后不同Cr3+添加水平对鲤心脏HSP70基因表达量的影响HSP70是一种多功能蛋白，当机体暴露于热应激环境中，细胞内持续合成HSP70，减少H2O2对细胞膜造成的损伤，维持正常细胞功能[23]。陆健等[24]对大口黑鲈“优鲈3号”的研究发现，急性高温胁迫引起肝脏和鳃组织中HSP70基因表达量显著上调，表明大口黑鲈“优鲈3号”在短时间应激时，可通过诱导产生合成HSPs蛋白提高机体耐受性，适应高温应激。类似的结果也出现在达氏鳇（Husodauricus）[25]、黄姑鱼（Nibea albiflora）[26]、尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）[27]以及美洲鲥（Alosasapidissima）[28]等研究中。本研究发现，1组（0.31 mg/kg Cr3+）试验鱼心脏HSP70基因表达量在热应激2~6 h内显著升高，说明试验鱼心脏组织通过大量表达HSP70蛋白抵抗外界不良环境条件的影响，与上述结果一致。此外，罗志成[29]对虹鳟（Oncorhynchus mykiss）的研究发现，热应激条件下，牛磺酸能够显著上调试验鱼心脏HSP70基因表达量，表明牛磺酸可提高虹鳟的抗热应激能力。本研究发现，蛋氨酸铬可在短时间内迅速上调热应激条件下鲤鱼心脏HSP70基因的表达量，且存在一定的剂量关系，说明热应激条件下鲤鱼心脏中HSP70基因的表达受Cr3+的调控。4结论在饵料中添加蛋氨酸铬可提高鲤免疫功能，上调HSP70基因的表达，缓解热应激对机体造成的损伤。Cr3+建议添加量为0.73 mg/kg。