豆粕是水产饲料工业中应用十分广泛的植物蛋白源，与鱼粉等动物蛋白质源相比，豆粕具有来源广、价格相对便宜以及不易被病原菌污染等特点。采用豆粕部分替代鱼粉已成为水产动物营养与饲料领域的研究热点[1]。但豆粕中含有多种抗营养因子[2]可对水产动物的生长代谢和健康状态产生负面影响，引起产品品质下降、生产效益受损等，限制了饲料中豆粕替代鱼粉的比例[3]。微生物发酵可促使原料中的部分多糖、蛋白质和脂肪等大分子物质降解，产生易被动物采食、消化和吸收的有机酸、可溶性多肽、单糖等小分子物质，改善原料适口性，提高利用效率[4-5]。近年来，发酵豆粕作为蛋白原料应用于水产养殖的研究逐渐增多。发酵饵料对鱼类产生多种有益影响，如促进有益菌在宿主肠道中的定植，改善肠道形态结构，促进肠道发育，提高生产性能等[6]。菌种是发酵饲料的核心，对发酵饲料应用效果具有决定性作用[7]。目前，许多水产发酵饵料的菌株分离自环境或者陆生动物，无法定植于水产动物消化道，难以发挥益生效果。研究表明，理想的益生菌应来自动物自身胃肠道[8]。因此，利用鱼类自身肠道有益微生物生产饵料得到学术界和产业的高度认同。本试验以前期筛选的乳酸乳球菌17、酿酒酵母菌Sa和短小芽孢杆菌SE5为发酵菌种分别固态发酵豆粕，并对发酵豆粕进行感官评价和理化性质分析，为水产动物功能性发酵豆粕饵料产业化提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1益生菌菌株乳酸乳球菌17分离自小丑鱼肠道，菌落为白色、湿润、极小，革兰氏阳性兼性厌氧菌；短小芽孢杆菌SE5（GenBank登录号：EU520340）分离自斜带石斑鱼肠道，菌落为乳白色、半透明、隆起、边缘整齐、菌落较小（直径0.5 mm），为革兰氏阳性好氧菌；酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）Sa源自大曲，菌落为乳白色、湿润、隆起、菌落整体黏稠、表面较光滑、质地较均匀、直径0.5~0.6 cm，兼性厌氧，由福建大北农水产科技有限公司提供。1.1.2培养基MRS肉汤培养基用作乳酸菌培养，YPD液体培养基用作酵母菌培养，2216E液体培养基用作海生细菌的培养。以上培养基均由青岛海博生物技术有限公司提供。1.2试验方法1.2.1发酵种子液的制备取200 μL菌种接种至50 mL液体培养基，30 ℃ 150 r/min活化24 h。以5%的接种量进行2次传代，根据菌株的生长曲线，取第二次传代对数生长期菌液作为发酵种子液。1.2.2固体发酵试验设定料液比为1∶1，各菌株发酵种子液以10%的接种量（干基接种量）配以灭菌的生理盐水，加入干基的1%葡萄糖混匀，接入定量豆粕（250~830 μm），基质含水量为50%。液体加入时均需搅拌均匀，8层纱布封瓶口，以牛皮纸包扎瓶口，30 ℃恒温发酵48 h。每组试验做3个重复。发酵样品低温保存。1.3测定指标及方法1.3.1营养成分粗脂肪含量参照GB/T 6433—2006方法测定；粗灰分含量参照GB/T 6438—2007方法测定；粗蛋白质含量参照GB/T 6432—2018方法；酸溶蛋白含量参照GB/T 22492—2008方法测定；大豆肽含量参照GB/T 22492—2008 附录B方法测定。0.1 g发酵豆粕加5 mL无菌的生理盐水，振荡混匀，静置20 min，取样品上清液，采用南京建成生物研究所试剂盒测定乳酸含量。以上指标委托谱尼测试集团深圳有限公司进行测定。1.3.2活菌数的测定采用稀释涂布平板的方法[9]测定活菌数，菌液分别涂布于2216E、孟加拉红培养基和MRS固体培养基，30 ℃培养48 h，检验各菌株对应的菌落形态，计算各菌株相应的菌落数。1.3.3粗蛋白表观消化率粗蛋白表观消化率参考GB/T 17811—2008和周根来等[10]方法测定，并适当调整。胃蛋白酶来自猪胃黏膜，酶活≥250 U/mg。胰蛋白酶来自猪胰腺，酶活1 000~2 000 U/mg。硫酸链霉素规格是720 IU/mg，氨苄青霉素钠规格为USP级。以上试剂均购自海麦克林生化科技有限公司。1.3.4大豆抗营养因子含量采用北京龙科方舟试剂盒（酶联免疫法）对大豆胰蛋白酶抑制因子含量、大豆球蛋白（glycinin）和β-伴大豆球蛋白含量（β-conglycinin）进行测定。1.4数据统计与分析数据采用Microsoft Excel 2013初步处理，采用SPSS 22.0进行单因素（One-way ANOVA）方差分析和Duncan's法多重比较。结果以“平均值±标准误”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1发酵豆粕感官评价（见图1、表1）由图1、表1可知，豆粕经益生菌发酵后，感官品质均有提升，颜色加深、有黏度、质地偏柔软黏稠和无豆腥味，其中乳酸乳球菌17发酵豆粕和酿酒酵母Sa发酵豆粕散发浓郁香味。乳酸乳球菌17发酵豆粕和酿酒酵母菌Sa发酵豆粕的豆粕形态呈凝聚状态，颜色呈深黄色，比发酵前色泽更深。短小芽孢杆菌SE5发酵豆粕凝聚更为紧密而结块，呈红褐色，与酸乳球菌17发酵豆粕和酿酒酵母Sa发酵豆粕相比更深。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.012.F001图 1烘干未粉碎发酵豆粕10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.012.T001表1发酵豆粕感官评价项目颜色黏度气味短小芽孢杆菌SE5红褐色强黏度无氨味乳酸乳球菌17黄色弱黏度酸香味酿酒酵母菌Sa黄色弱黏度芳香味2.2益生菌对发酵豆粕中活菌数的影响（见表2）由表2可知，乳酸乳球菌17、酿酒酵母菌Sa和短小芽孢杆菌SE5发酵后活菌数量均呈数量级增加，说明3株菌株均可利用豆粕作为营养物质增殖。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.012.T002表2益生菌对发酵豆粕中活菌数的影响项目发酵前发酵后乳酸乳球菌17发酵豆粕2.25×1042.69×107酿酒酵母菌Sa发酵豆粕7.00×1051.78×109短小芽孢杆菌SE5发酵豆粕6.06×1056.66×1010CFU/g2.3益生菌对发酵大豆抗营养因子含量的影响（见表3）由表3可知，与未发酵豆粕相比，各发酵组豆粕中的3种抗营养因子含量均显著降低（P0.05）。各发酵豆粕组中大豆胰蛋白酶抑制剂去除率均达97%以上。大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白含量根据发酵菌种不同呈现较大差异，去除效果从高到低依次为短小芽孢杆菌SE5、乳酸乳球菌17和酿酒酵母菌Sa。大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白去除率均以短小芽孢杆菌SE5最佳。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.012.T003表3益生菌对发酵豆粕大豆抗营养因子含量的影响项目大豆胰蛋白酶抑制剂大豆球蛋白β-伴大豆球蛋白豆粕（未发酵）19.40±0.12a146.39±3.05a121.01±1.57a短小芽孢杆菌SE50.52±0.02b16.35±4.07c50.79±5.11d乳酸乳球菌170.29±0.03c91.79±2.64b91.37±1.24c酿酒酵母菌Sa0.24±0.02c92.13±1.63b104.55±0.95b注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。mg/g2.4益生菌对发酵豆粕的常规营养成分和粗蛋白表观消化率的影响（见表4）由表4可知，各发酵豆粕组粗蛋白质含量均超过53%，均显著高于未发酵豆粕（P0.05），超过NY/T 2218—2012规定的发酵豆粕粗蛋白质含量。短小芽孢杆菌SE5和乳酸乳球菌17发酵豆粕的粗脂肪含量均有所提高，乳酸乳球菌17发酵豆粕的粗脂肪含量最高，达2.06%。3种益生菌发酵豆粕的粗灰分含量均低于豆粕组，可能是由于微生物发酵过程中利用了部分无机盐，造成粗灰分含量偏低。3种益生菌发酵豆粕的粗蛋白表观消化率与未发酵前相比均显著提高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.012.T004表4益生菌对发酵豆粕的常规营养成分和粗蛋白表观消化率的影响项目粗蛋白粗脂肪粗灰分粗蛋白表观消化率豆粕（未发酵）47.88±0.07c0.90±0.02c6.96±0.02a42.00±0.23c短小芽孢杆菌SE555.66±3.15ab1.08±0.06b6.00±0.06c50.05±0.32a乳酸乳球菌1753.43±0.14b2.06±0.01a6.93±0.02a51.30±1.32a酿酒酵母菌Sa56.09±0.42a0.93±0.05c6.55±0.04b46.90±0.46b%2.5益生菌对发酵豆粕的酸溶蛋白和大豆肽含量的影响（见表5）由表5可知，短小芽孢杆菌SE5和乳酸乳球菌17发酵后大豆肽和酸溶蛋白含量比发酵前显著提高（P0.05），酿酒酵母Sa发酵豆粕的大豆肽和酸溶蛋白含量略高于豆粕，但差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.012.T005表5益生菌对发酵豆粕的酸溶蛋白和大豆肽含量的影响项目大豆肽酸溶蛋白豆粕（未发酵）1.16±0.17c1.45±0.13c短小芽孢杆菌SE511.25±0.55a12.76±0.59a乳酸乳球菌176.53±0.15b6.95±0.16b酿酒酵母菌Sa1.77±0.14c1.81±0.14cg/100 g3讨论3.1益生菌发酵豆粕感官评价本试验中，豆粕经益生菌发酵后，颜色呈不同程度加深，说明在相同发酵条件下不同菌种发酵豆粕的感官效果存在差异，原因可能是经发酵后豆粕基质本身的色素遭到破坏或产生较多新的色素[11]。发酵豆粕的黏度增大，主要是由于水和微生物的共同作用，豆粕的理化性质发生改变，小分子蛋白质和小肽含量增多并且随着发酵时间的延长黏度不断增大[12]。短小芽孢杆菌SE5发酵豆粕呈强黏度，原因可能是发酵后活菌数更高发酵作用更强烈，产生更多的可溶性蛋白，增加豆粕的黏度。本试验中，乳酸乳球菌17发酵豆粕散发酸香味，主要原因可能是豆粕发酵产生大量乳酸等有机酸，中和一部分胺类物质，改善发酵产物的风味[13]；而酿酒酵母菌Sa发酵豆粕散发芳香味的原因，可能是细菌的代谢活动在固态条件下传质传热障碍产生醇味物质[14]，微生物代谢产生的此类物质赋予了发酵豆粕特有的风味，提高了豆粕的适口性。3.2益生菌对发酵豆粕抗营养因子含量的影响发酵是去除大豆中抗营养因子的一种绿色有效的生物学方法。本试验中，短小芽孢杆菌SE5、酿酒酵母Sa和乳酸乳球菌17发酵豆粕的大豆胰蛋白酶抑制因子的去除率均达97%以上。Chi等[15]研究发现，使用解淀粉芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌通过固态发酵可去除大豆胰蛋白酶抑制因子。解淀粉芽孢杆菌能够分泌一种强蛋白酶，是一种能够分解包括胰蛋白酶抑制因子在内的蛋白质。由于抗原蛋白结构含有二硫键，能够维持蛋白的结构强度，使其不易被破坏。因此，饲料加工过程不能去除大分子蛋白质，鱼类对大豆抗原蛋白的耐受性是影响发酵豆粕替代鱼粉比例的主要因素[6]。本试验中，大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白降解率均以短小芽孢杆菌SE5最佳，去除率分别为88.83%和58.03%。史艳丽等[16]研究指出，枯草芽孢杆菌XZ35株发酵豆粕后抗原蛋白残留率为5.9%。Yao等[17]使用芽孢杆菌N-11发酵使豆粕中大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白含量分别降低82.38%和88.32%，可能是微生物代谢产生的蛋白酶类物质将这些抗原蛋白分解成小分子肽类或者氨基酸[18]。3.3益生菌对发酵豆粕营养成分及粗蛋白表观消化率的影响本试验中，与对照组相比，益生菌发酵豆粕的粗脂肪和粗蛋白含量均有不同程度的提高，可能是在发酵过程中微生物生长代谢消耗部分有机物；营养成分中的粗脂肪和粗蛋白质相对含量增加[19]，可能是部分微生物利用豆粕中的氮源合成自身高质量的菌体蛋白[20]，使粗蛋白含量相对增加。Chi等[15]采用解淀粉芽孢杆菌、乳酸菌、植物乳酸菌和啤酒酵母菌分别发酵豆粕，蛋白质含量分别提高6.42％、0.95％、1.91％和5.61％。刘剑飞[21]将枯草芽袍杆菌、酿酒酵母和植物乳酸杆菌混合菌通过发酵，结果发现，豆粕的粗蛋白含量达53.51%。李莹等[22]分析从各地购买的发酵豆粕样品营养成分，结果发现，发酵豆粕粗蛋白质含量较普通豆粕样品高7%。不同的菌株具有不同的酶系或其他生物功能，发酵可得到不同降解程度的大豆蛋白，肽链片段有长有短，末端的氨基酸种类和带电性各不相同，各类菌的发酵豆粕在酸性溶液的溶解度不同。因此，不同菌株发酵豆粕的酸溶蛋白和大豆肽含量存在较大差异[23-24]。本试验中，3种益生菌发酵豆粕的体外粗蛋白消化率均显著上升，发酵过程中大分子蛋白质被微生物分解成小分子物质，可溶性的蛋白质含量增加，体外粗蛋白表观消化率增加；与未发酵豆粕相比，3种益生菌发酵豆粕的酸溶蛋白和大豆肽含量均有提高，但差异较大。郑丽等[25]通过发酵豆粕的X-衍射图发现，发酵可显著提高豆粕蛋白中的β-折叠结构，而β-折叠结构的比例与大豆蛋白溶解度存在正向关系，大豆肽中小肽之间的转运无竞争性抑制，转化利用率高，蛋白质合成加快。因此，通过发酵能够提高豆粕的营养价值。4结论3种益生菌发酵豆粕的感官状态、颜色、黏度和气味均有所改善，且益生菌发酵豆粕的大豆胰蛋白酶抑制因子基本上得到降解，大豆抗原蛋白含量显著降低，粗蛋白、酸溶蛋白、大豆肽和粗蛋白消化率与发酵前相比均有所提高，乳酸乳球菌17和短小芽孢杆菌SE5发酵豆粕的粗脂肪有所增加。短小芽孢杆菌SE5发酵豆粕各项指标均较为优秀，可作为日后发酵豆粕的首选菌种之一。