我国限制在畜禽饲料中使用抗生素[1-2]。随着畜禽相关益生菌的开发应用，微生物制剂可作为饲料添加剂替代抗生素[3]。微生物制剂能够有效调节动物肠道微生态平衡[4]，提升动物健康水平[5]，提高动物生产性能[6]，能够有效替代抗生素[7]。畜禽肠道和粪便中分离筛选得到的一些益生菌可满足某些功能需求[8]，包括安全性、功能性和有益特性等[9]。益生菌可产生有机酸、细菌素等抑菌物质抑制病原菌的生长，改善肠道微生态平衡[10-11]。乳酸菌是益生菌应用的主要微生物，也是畜禽肠道有益微生物群的重要组成部分，可明显改善宿主健康状况[12]。唾液乳杆菌作为乳酸菌的重要一员，广泛存在于人类和畜禽消化道中；唾液乳杆菌的微生物制剂也广泛应用于饲料、食品、医疗等领域[13]，是国家卫生部批准的食品可添加菌种之一。目前，唾液乳杆菌应用于在畜禽饲料的相关研究较多[14]。研究表明，饲喂唾液乳杆菌可改善畜禽肠道微生物区系结构，缓解病菌感染引起的炎症损伤，增强宿主对病菌的抵抗力[15]。本研究通过从猪场新鲜仔猪粪便中分离纯化得到一株唾液乳杆菌疑似菌株，进行外观形态、生化特性、分子生物学鉴定，确定其为唾液乳杆菌，该菌株具有良好的抑菌特性。试验旨在为新型替抗饲料的研究与发展提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验样品样品为出生30 d内的仔猪新鲜粪便，采自河南省济源市猪场。1.1.2试剂与培养基酵母膏、蛋白胨、葡萄糖、硫酸镁、氯化钠、碳酸钙、琼脂粉等均为国产分析纯试剂；细菌DNA提取试剂盒、革兰氏染色试剂盒、乳酸含量测定试剂盒等购自北京索莱宝科技有限公司；Mix酶、引物等购自华大基因公司；乳酸菌生化鉴定试剂盒购自青岛海博生物公司。抑菌试验所用沙门氏菌由河南省微生物工程重点实验室提供；人工胃液和人工肠液依照《中国药典》2010年版附录进行配制。MRS培养基：蛋白胨1%、牛肉膏1%、酵母膏0.5%、柠檬酸二铵0.2%、乙酸钠0.5%、葡萄糖2%、吐温8%、硫酸镁0.05%、硫酸锰0.025%、琼脂粉2%，121 ℃灭菌20 min。营养琼脂培养基：蛋白胨1%、牛肉膏0.3%、氯化钠0.5%、琼脂粉2%，121 ℃灭菌20 min。LB液体培养基：蛋白胨1%、酵母膏0.5%、氯化钠1%，121 ℃灭菌20 min。碳酸钙培养基：蛋白胨1%、牛肉膏1%、酵母膏0.5%、柠檬酸二铵0.2%、乙酸钠0.5%、葡萄糖2%、吐温8%、硫酸镁0.05%、碳酸钙1%、硫酸锰0.025%、琼脂粉2%，121 ℃灭菌20 min。1.1.3主要仪器超微量蛋白核酸分析仪（赛默飞公司）、Thermoblock PCR扩增仪（Biometra设备公司）、DYY6C电泳仪（北京六一仪器厂）、Bio-Rad分子成像仪（Bio-Rad公司）、Axio Image M2全自动正置荧光显微镜（zeiss公司）。1.2测定指标及方法1.2.1样品采集无菌样品盒收集仔猪新鲜排泄粪便，放入无菌袋，低温冰盒保存。1.2.2菌株筛选称取1 g样品以无菌双蒸水混匀，8 000 r/min离心5 min取上清液，按10-1、10-3、10-5、10-7浓度梯度稀释，分别吸取100 μL涂布MRS平板，37 ℃培养48 h，挑取不同形态菌落于MRS平板划线纯化，挑出唾液乳杆菌疑似菌株保存。1.2.3外观形态鉴定挑取唾液乳杆菌疑似菌株的单菌落接种于MRS平板，观察菌落外观、形态、颜色等，利用革兰氏染色试剂盒对疑似菌株进行革兰氏染色，显微镜观察形态并记录。1.2.4生理生化鉴定采用筛选得到的目标菌株制作菌悬液，采用乳酸菌生化鉴定试剂盒（青岛海博生物技术有限公司）对目标菌株进行生化特性鉴定，包括七叶苷、纤维二糖、麦芽糖、甘露醇、水杨苷、山梨醇、蔗糖、棉籽糖、菊糖、乳糖、马尿酸钠等。将目标菌株提前接种于MRS平板培养24 h，制成菌悬液加入生化鉴定管中37 ℃培养24 h。1.2.5分子生物学鉴定对筛选得到的疑似唾液乳杆菌菌株接种MRS液体培养基37 ℃摇床培养24 h，采用细菌DNA提取试剂盒对菌株基因组进行提取，采用超微量蛋白核酸分析仪检查提取基因组质量，将合格样品作为模板进行PCR扩增，正向引物为27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTAG-3'），反向引物为1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'），PCR反应体系和反应条件见表1、表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.018.T001表1PCR反应体系项目体积合计50BGI2×Super PCR Mix（with dye）25正向引物1反向引物1模板1dd H2O22μL10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.018.T002表2PCR反应程序项目反应温度/℃反应时间预变性944 min变性9430 s退火6030 s延伸721 min 30循环终延伸725 min扩增后产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，送至华大基因公司测序，将拼接序列输入NCBI数据库和模式菌株进行序列比对，采用发育树软件MEGA 7.0进行系统发育树的构建。1.2.6抑菌试验抑菌试验采用滤纸片法，沙门氏菌接种于LB液体培养基37 ℃摇床培养24 h，均匀涂布于营养琼脂平板，将灭菌的滤纸片放置于涂布平板；唾液乳杆菌疑似菌株于MRS液体培养基37 ℃摇床培养48 h，菌液离心取上清液，滤纸片上滴加唾液乳杆菌疑似菌株离心上清液10 μL，37 ℃培养24 h，观察并测定抑菌圈直径。1.2.7产酸含量测定将菌株点接于碳酸钙平板，37 ℃培养24 h，观察碳酸钙透明圈的直径大小，采用试剂盒测定该菌株的乳酸产生量。1.2.8胃肠道耐受试验唾液乳杆菌疑似菌株于MRS液体培养基37 ℃摇床培养48 h，12 000 r/min离心10 min收集菌体，置于1 mL无菌水制成菌悬液。于人工胃液、人工肠液、灭菌生理盐水中分别加入0.1 mL菌悬液，37 ℃摇床培养6 h，取3瓶MRS液体培养基分别加入0.1 mL的培养液，37 ℃摇床培养24 h，于600 nm测定人工胃液MRS培养吸光度、人工肠液MRS培养吸光度、生理盐水MRS培养吸光度。人工胃液MRS培养吸光度与生理盐水MRS培养吸光度比值为人工胃液存活率，人工肠液MRS培养吸光度与生理盐水MRS培养吸光度比值为人工肠液存活率。2结果与分析2.1菌株分离纯化结果唾液乳杆菌外观形态特征见图1。猪场新鲜仔猪粪便中筛选得到的唾液乳杆菌疑似菌株，编号SWS30，挑取单菌落划线接种MRS平板。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.018.F001图1唾液乳杆菌外观形态特征（a）菌株SWS30外观形态 （b）菌株SWS30革兰氏染色图由图1（a）可知，此菌株菌落较小，呈乳白色，边缘整齐；由图1（b）可知，革兰氏染色呈阳性。2.2SWS30的生理生化鉴定结果（见表3）由表3可知，该菌株可发酵纤维二糖、麦芽糖、甘露醇、水杨苷、山梨醇、蔗糖、棉籽糖、菊糖、乳糖、马尿酸钠，不发酵七叶苷。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.018.T003表3SWS30的生理生化鉴定结果项目结果七叶苷-纤维二糖+麦芽糖+甘露醇+水杨苷+山梨醇+蔗糖+棉籽糖+菊糖+乳糖+1%马尿酸钠+注：“+”表示阳性；“-”表示阴性。2.3SWS30的分子生物学鉴定结果（见图2）由图2可知，筛选得到的目标菌株提取基因组，经检验合格进行16S rDNA 扩增、DNA凝胶电泳，序列序列长度为1 439 bp。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.018.F002图2SWS30的分子生物学鉴定结果注：M为DL2 000 plus ladder；SWS30为唾液乳杆菌16S rDNA基因。2.4唾液乳杆菌系统发育树（见图3）由图3可知，试验菌株与唾液乳杆菌相似性达100%，利用发育树软件MEGA 7.0构建系统发育树；结合该菌株的外观形态特征、生化鉴定结果及分子生物学结果确定其为唾液乳杆菌。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.018.F003图3唾液乳杆菌系统发育树2.5SWS30抑制沙门氏菌抑菌圈（见图4）由图4可知，试验组抑菌圈直径明显大于对照组，试验组沙门氏菌抑菌圈外径达13.44 mm，表明此唾液乳杆菌的上清液可抑制沙门氏菌生长，且效果显著，推测可能与该菌代谢所产生的乳酸有关。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.018.F004图4SWS30抑制沙门氏菌抑菌圈2.6SWS30产酸结果（见图5）由图5可知，透明圈外径和唾液乳杆菌菌落直径比值达2.5，表明该菌株具有较强的产酸能力；为检验该菌株产乳酸能力，采用试剂盒测定该菌株的乳酸产生量，结果为77.38 mmol/L。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.018.F005图5SWS30碳酸钙透明圈2.7胃肠耐受试验结果在人工胃液的强酸性环境和人工肠液的强碱性环境下，大多数的微生物的生长受到抑制。通过600 nm测定菌人工胃液存活率和人工肠液存活率，结果发现，人工胃液存活率达81%，人工肠液存活率达73%，表明该菌株易于在胃肠道中定植。3讨论益生菌能够产生有机酸等抑菌物质，抑制病原菌生长[16]，改善动物肠道微生态平衡，提高动物机体免疫力，且不产生任何耐药性[17]。唾液乳杆菌作为益生菌领域的重要一员，具有多种益生功能，能够提高动物肠道消化吸收率[18]，减弱有害菌在肠道的定植[19]。本研究通过猪场新鲜仔猪粪便筛选纯化得到一株唾液乳杆菌疑似菌株，经过外观形态鉴定、生化分析、分子生物学鉴定等手段，确定其为唾液乳杆菌。该菌株来自仔猪粪便，属动物源性益生菌[20]，且在胃肠环境生存良好，保证其安全性及在动物肠道的适应性，利于在动物微生态制剂中的应用。通过抑菌试验发现，该菌株对沙门氏菌表现显著的抑制作用；通过乳酸含量测定结果发现，该菌株具有较强的产乳酸能力。4结论本试验筛选得到的唾液乳杆菌具有一定的益生特性，可以成为应用于畜禽养殖领域的潜力菌株。