二色补血草（Limonium bicolor）为白花丹科补血草属，是滨海地区分布广泛的多年生、耐盐碱草本植物。二色补血草具有抑菌抗炎、止血化瘀的功效[1]。二色补血草开花前可作为畜禽饲料，弥补春季饲料的缺乏[2]。二色补血草具有促进动物的造血、补血和止血的功效[3-5]。二色补血草含有的天然活性物质具有抗肿瘤、抗氧化、调节免疫、护肝、抑菌[6]和延长动物生育期[7]等多种生物学功能。总黄酮是二色补血草植物中的主要化学活性成分。总黄酮作为天然饲料添加剂和抗氧化剂能够显著促进动物生长发育[8-9]，提高畜禽生产性能[10]，增强机体免疫力[11-12]，提高畜产品质量[13-14]，维持肠道健康[15]，抗菌消炎[16-17]，提高机体的抗氧化能力[9,18]。目前，植物总黄酮的提取方法及提取工艺优化方法较多，如微波提取法[19]、酶解法[20]、有机溶剂提取法[21]、超声波辅助提取法[22]等。相对传统的溶剂提取法，超声辅助提取法具有省时、节能、提取率高的优势，广泛应用于多种天然产物的提取。响应面法是通过回归方程方差分析拟合自变量与响应值之间的关系而探究最佳工艺条件的方法，计算简便、快捷，已普遍应用于微生物发酵饲料条件的优化及植物活性产物的提取[23]。本研究采用超声波辅助提取二色补血草总黄酮，依据单因素试验，以总黄酮的提取率为响应值，采用响应面分析法设计试验，优化二色补血草总黄酮的最佳提取工艺，初步探究温度和光照对二色补血草中总黄酮稳定性的影响；采用纸片琼脂扩散法研究总黄酮抑菌活性，确定二色补血草总黄酮对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、毛霉、黑曲霉的抑制作用，以期为二色补血草总黄酮提取工业化生产及在饲料添加剂中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料与仪器试验材料为沧州海兴湿地新鲜、完整、无蛀虫、长势好的二色补血草植株。将二色补血草植株清洗剪碎，烘干，粉碎过60目筛，得到二色补血草干粉，干燥密封袋封口保存。芦丁标准品（合肥博美生物科技有限公司）；无水乙醇（天津市北联精细化学品开发有限公司）；Al(NO3)3、NaNO2、NaOH（天津市盛奥化学试剂有限公司）；牛肉膏、蛋白胨、胰蛋白胨、酵母粉（北京奥博星生物技术有限公司）；NaCl（天津市大茂化学试剂厂）；琼脂粉（北京双旋微生物培养基制品厂）；葡萄糖（天津市标准科技有限公司）。供试菌株枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、毛霉和黑曲霉，均由沧州师范学院生命科学学院微生物实验室提供。DHG-9140A数显电热鼓风干燥箱（上海东麓仪器设备有限公司）；LD5-2A低速离心机（北京雷勃尔医疗器械有限司）；1000C粉碎机（温岭市林大机械有限公司）；HH-4电热恒温水浴锅（北京科伟永兴仪器有限公司）；FS-250N超声波清洗机（上海生析超声仪器有限公司）；LRH-150生化培养箱（上海一恒科技有限公司）；723可见分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）；SW-CJ-1F超净工作台（杭州川一实验仪器有限公司）。1.2试验方法1.2.1二色补血草总黄酮提取工艺的优化1.2.1.1芦丁标准曲线的绘制[24]称取20 mg芦丁标准品，使用60%乙醇定容至100 mL，得到0.2 g/L的标准溶液。分别移取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL芦丁标准溶液于25 mL容量瓶中，分别加入5% NaNO2溶液1.0 mL，摇匀，静置6 min；分别加入5% Al(NO3)3溶液1.0 mL，摇匀，静置6 min；分别加入10.0 mL的NaOH（4%）溶液，采用乙醇（60%）稀释至25 mL，摇匀后静置反应15 min，510 nm波长处测定各溶液的光密度（OD）值。以OD值为纵坐标，芦丁标准溶液的浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到回归方程y=10.384x+0.002 5，R2=0.999 4。1.2.1.2二色补血草总黄酮提取液的制备及总黄酮的测定[25]称取二色补血草干粉1 g，加入10 mL 60%乙醇，超声功率240 W条件下提取40 min，4 000 r/min离心10 min，即为二色补血草总黄酮提取液。取上清液5 mL，按照1.2.1.1的方法，510 nm波长处测定OD值，按照标准曲线方程，计算样品浓度，按下面公式计算总黄酮提取率。总黄酮提取率=C×V1×V2/V3/m×100%                    (1)式中：C为标准曲线中样品液的浓度（g/L）；V1为显色剂的体积（25 mL）；V2为提取液的总体积（50 mL）；V3为进行试验的提取液体积（5 mL）；m为样品质量（g）。1.2.1.3单因素试验试验考察与二色补血草总黄酮超声提取直接相关的5个自变量因素：超声功率、乙醇浓度、提取时间、料液比、提取温度。每个因素分别选取5个水平，单因素试验设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.016.T001表1单因素试验设计水平乙醇浓度/%料液比/(g/mL)提取时间/min提取温度/℃超声功率/W1301∶1020301802401∶2030402103501∶3040502404601∶4050602705701∶5060703001.2.1.4响应面试验依据单因素试验结果，采用软件Design-Expert11，利用Box-Benhnken中心组合设计3因素3水平的响应面试验[26]。选取料液比、乙醇浓度和超声功率为自变量，以二色补血草总黄酮提取率为响应值，确定二色补血草总黄酮的最佳提取工艺参数。响应面试验因素水平见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.016.T002表2响应面试验因素水平水平A料液比/(g/mL)B乙醇浓度/%C超声功率/W-11∶103018001∶305024011∶50703001.2.2二色补血草总黄酮稳定性的测定1.2.2.1光照对二色补血草总黄酮稳定性的影响分别取二色补血草总黄酮提取液50.0 mL于3个锥形瓶中，锥形瓶分别置于室外太阳光、室内自然光和室内避光条件下，保存0、2、4、6、8、10 h，测定510 nm的OD值，记录数据，探究光照对二色补血草总黄酮稳定性的影响[27]。1.2.2.2温度对二色补血草总黄酮稳定性的影响分别取二色补血草总黄酮提取液10 mL于6支试管中，试管分别置于-18、0、4、30、40、70 ℃条件下处理1 h，冷却至室温，测定510 nm的OD值，记录数据，探究温度对二色补血草总黄酮稳定性的影响[28]。1.2.3二色补血草总黄酮抑菌性的测定1.2.3.1菌种的活化将枯草芽孢杆菌、大肠杆菌分别接种到LB培养基中进行斜面活化，37 ℃恒温培养箱内培养24 h；将黑曲霉、毛霉分别接种于PDA培养基进行斜面活化，28 ℃恒温培养48 h。1.2.3.2菌悬液的制备分别从斜面上挑取一定量枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、黑曲霉、毛霉菌落与灭菌生理盐水混匀，配制一定浓度的菌悬液。1.2.3.3抑菌作用的测定选择直径10 mm的打孔器将滤纸打成整齐的圆片，灭菌后备用。取不同浓度的枯草芽孢杆菌、大肠杆菌菌悬液分别接种至LB培养基；将黑曲霉、毛霉菌悬液分别接种至PDA培养基，设置3次重复。将二色补血草总黄酮提取液使用无菌水稀释为0.054、0.108、0.162、0.216、0.270 g/L的样品溶液，将无菌滤纸圆片置于不同浓度的总黄酮稀释液中，浸泡30 min以上，采用灭菌后的镊子取出，在已接菌的培养基中分别放置不同浓度的3个滤纸片，空白对照为无菌水。按照1.2.3.1的方法进行培养，观察总黄酮的抑菌作用[29]。1.3数据统计与分析二色补血草总黄酮提取单因素试验均设置3次重复，取平均值。采用Excel 2019软件统计分析试验数据；利用Design-Expert11软件中的Box-Behnken法设计响应面优化试验方案，并对所得数据进行统计分析，获取回归模型及最佳提取工艺参数。2结果与分析2.1二色补血草总黄酮超声辅助提取单因素试验结果2.1.1乙醇浓度对总黄酮提取率的影响（见图1）由图1可知，乙醇浓度30%~70%范围内，总黄酮提取率呈先升后降的趋势，50%时总黄酮提取率达最大值3.12%；随着乙醇浓度继续增大，总黄酮提取率快速下降。原因可能是过高的乙醇浓度导致溶液极性减小，可溶性黄酮成分含量减少，导致总黄酮提取率降低。因此，最佳乙醇浓度为50%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.016.F001图1乙醇浓度对总黄酮提取率的影响2.1.2料液比对总黄酮提取率的影响（见图2）由图2可知，总黄酮提取率随料液比增大呈上升趋势；当料液比达到1∶40时，总黄酮提取率达最大值2.95%；继续增大料液比，总黄酮提取率开始降低。原因可能是溶剂过少时，提取液浓度过高，不利于总黄酮的充分溶出；当料液比过大时，溶剂过多，总黄酮的溶出已达极限，其他物质溶解增多，导致总黄酮提取率降低。因此，最佳料液比为1∶40。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.016.F002图2料液比对总黄酮提取率的影响2.1.3提取时间对总黄酮提取率的影响（见图3）由图3可知，总黄酮提取率在提取20~50 min内呈上升趋势，50 min时提取率可达峰值2.87%；增加提取时间，总黄酮提取率明显降低。原因可能是提取时间过短时总黄酮未能充分溶出；在合适的提取时间，超声的空化作用加大物质与溶剂的接触面积，物质溶解充分，提取率升高；超声时间过长，溶剂挥发，总黄酮结构可能被分解破坏，造成提取率降低。因此，最佳超声时间为50 min。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.016.F003图3提取时间对总黄酮提取率的影响2.1.4提取温度对总黄酮提取率的影响（见图4）由图4可知，温度30~70 ℃范围内，总黄酮提取率呈先升高后降低的趋势，超声温度达40 ℃时，总黄酮提取率达最大值2.97%；继续增大提取时间，提取率开始降低。原因可能是随着提取温度升高，溶剂黏度减小，总黄酮的溶出增大，活性成分的扩散加快，总黄酮提取率提高；高温导致乙醇挥发，固液比增大，杂质溶出量增加，总黄酮提取率减少。因此，最佳提取温度为40 ℃。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.016.F004图4提取温度对总黄酮提取率的影响2.1.5超声功率对总黄酮提取率的影响（见图5）由图5可知，总黄酮提取率在超声功率为180~240 W时迅速升高，且在240 W时达最大值2.90%，继续增大超声功率后提取率迅速下降。原因可能是超声空化作用的增大，有利于黄酮的释放，但升高超声功率可造成一些分解酶释放，导致总黄酮被破坏，提取率下降。因此，最佳超声功率是240 W。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.016.F005图5超声功率对总黄酮提取率的影响2.2响应面法优化二色补血草总黄酮提取工艺2.2.1响应面试验结果响应面试验结果见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.016.T003表3响应面试验设计方案及结果试验号A料液比B乙醇浓度C超声功率总黄酮提取率/%1-10-12.03920003.28230003.438401-12.68251102.9066-1-102.0257-1012.56380003.45790003.29610-1102.489110-1-12.755120003.357130112.808140-112.9031510-12.955161-102.711171012.8662.2.2响应面模型的建立以二色补血草总黄酮提取率为考察指标，利用软件Design-Expert11对表3结果进行多元线性回归分析和二次项方程拟合，得到总黄酮提取率（Y）对料液比（A）、乙醇浓度（B）和超声功率（C）的回归数学模型为：Y=3.37+ 0.290 3A+0.061 4B +0.088 6C-0.067 3AB-0.153 3AC-0.005 5BC-0.507 3A2-0.326 0B2-0.253 0C22.2.3响应面回归模型的方差分析结果（见表4）由表4可知，模型F值为19.24，说明模型具有重要意义。回归模型P值为0.000 4，达到极显著水平（P0.01），失拟项不显著，说明模型回归显著可靠，模型成立。模型的相关系数R2=0.961 1，表明总黄酮提取率的实际值与预测值之间具有较好的拟合度，试验误差较小。模型的调整决定系数R2adj=0.911 2，说明有91.12%的总黄酮提取条件可以用该模型进行分析解释。一次项因素A和二次项因素A2、B2、C2对总黄酮提取率的影响表现为极显著水平（P0.01）；二次项交互因素AC对总黄酮的提取率的交互影响表现为显著水平（P0.05）。因此各因素对二色补血草总黄酮提取率不是简单线性关系，而是存在一定交互作用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.016.T004表4响应面回归模型方差分析表结果方差来源平方和自由度均方F值P值显著性模型2.870 090.318 619.240.000 4**A料液比0.674 010.674 040.700.000 4**B乙醇浓度0.030 110.030 11.820.219 3C超声功率0.062 810.062 83.790.092 4AB0.018 110.018 11.090.330 7AC0.093 910.093 95.670.048 8*BC0.000 110.000 10.007 30.934 3A²1.080 011.080 065.420.000 1**B²0.447 510.447 527.020.001 3**C²0.269 510.269 516.280.005 0**残差0.115 970.016 6失拟项0.090 430.030 14.730.083 8纯误差0.025 540.006 4总和2.980 016注：“**”表示影响极显著（P0.01）；“*”表示影响显著（P0.05）。F值越大，对响应值的影响越大。FA=40.70，FB=1.82，FC=3.79，因此各因素对总黄酮提取率的影响程度为：料液比超声功率乙醇浓度。2.2.4响应面模型分析（见图6~图8）将回归方程中任意1个因素固定在编码值零水平，利用Design-Expert11软件分析两个交互因素对二色补血草总黄酮提取率的影响。由图6可知，随着料液比和乙醇浓度的升高，总黄酮提取率呈先升后降的趋势，料液比相对应的曲面倾斜度比乙醇浓度高，说明料液比对总黄酮提取率的影响比乙醇浓度大。等高线呈圆形，表示两因素的交互作用不显著，与回归模型方差分析AB项的结果一致。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.016.F006图6料液比和乙醇浓度的交互作用由图7可知，随着料液比和超声功率的升高，总黄酮提取率呈先升后降的趋势，料液比相对应的曲面倾斜度比超声功率的高，说明料液比对总黄酮提取率的影响比超声功率大。等高线呈椭圆形，表示两因素的交互作用显著，与回归模型方差分析AC项的结果一致。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.016.F007图7超声功率和料液比的交互作用由图8可知，随着乙醇浓度和超声功率的升高，总黄酮提取率呈先升后降的趋势，超声功率的曲面倾斜度比乙醇浓度高，但差异不大。等高线呈圆形，表示两因素的交互作用不显著，与回归模型方差分析BC项的结果一致。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.016.F008图8超声功率和乙醇浓度的交互作用2.2.5验证试验由Design-Expert11软件中的RSM预测最佳试验条件，模拟出超声波辅助提取二色补血草总黄酮的最佳条件为：乙醇浓度51.32%、料液比1∶35.36、超声功率245.59 W。此条件下，二色补血草总黄酮提取率预测值为3.41%。根据试验的可操作性，最终设定工艺条件为：料液比1∶35、乙醇浓度51%、超声功率250 W。此条件下进行平行试验3次，实际总黄酮提取率为3.32%，与预测值接近。2.3二色补血草总黄酮的稳定性2.3.1光照对二色补血草总黄酮稳定性的影响（见图9）由图9可知，在光照时间0～10 h范围内，3种光照条件下提取液中总黄酮含量均逐渐降低。在室外太阳光的照射下，提取液中总黄酮的吸光度明显下降，10 h之内降低15%。在室内自然光的照射下，时间越长，提取液中总黄酮的吸光度下降越大。而避光条件下提取液中总黄酮的吸光度在10 h内变化幅度最小。原因可能是总黄酮对室外紫外线比较敏感，其结构在太阳光的照射下被破坏分解；而避光保存对其稳定性影响最小。因此，在二色补血草总黄酮的生产和贮藏过程中适宜避光，室内自然光适宜短期贮藏。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.016.F009图9光照对二色补血草总黄酮稳定性的影响2.3.2温度对二色补血草总黄酮稳定性的影响（见图10）由图10可知，随着温度的升高，总黄酮含量呈现先升后降的趋势。温度在-20~4 ℃时，提取液中总黄酮含量呈上升趋势；温度在4~70 ℃时，总黄酮含量随着温度的升高逐渐下降；在70 ℃的条件下，时间越长，提取液中总黄酮的吸光度下降愈为明显。原因可能是低温条件下分子间运动缓慢，而随着温度的升高，分子活跃度加快，促进总黄酮结构的分解破坏。因此，在总黄酮适宜在低温环境下加工和保存。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.016.F010图10温度对二色补血草总黄酮稳定性的影响2.4二色补血草总黄酮的抑菌效果（见表5）黄酮类物质属于多酚类化合物，pH值呈偏酸性，可使菌类细胞蛋白变性而破坏细胞膜的完整性，使微生物产生功能障碍，从而抑制菌类生长。由表5可知，二色补血草总黄酮对细菌和真菌均有不同程度的抑菌效果，对4种菌株的最小抑菌浓度为0.162 g/L。随着浓度的增加，二色补血草总黄酮对枯草芽孢杆菌和毛霉的抑菌作用最大，对大肠杆菌和黑曲霉的抑菌作用明显且程度相当。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.016.T005表5不同浓度二色补血草总黄酮提取液抑菌效果菌种浓度/(g/L)00.0540.1080.1620.2160.270大肠杆菌---+++++枯草芽孢杆菌---+++++++黑曲霉---+++++毛霉---+++++++注：“-”表示无抑菌效果，菌落正常生长；“+”表示有抑菌效果，“+”越多表示抑菌作用越大。3结论采用响应面分析法优化超声辅助提取二色补血草总黄酮的工艺，优化后最佳工艺参数为：乙醇浓度51%、料液比1∶35、超声功率250 W。此条件下，总黄酮提取率为3.32%。二色补血草总黄酮在低温及避光条件下稳定性表现较好，且对不同细菌和真菌起到不同程度的抑制作用。