团头鲂（Megalobrama amblycephala），俗称鳊鱼、草鳊等，属鲤形目鲤科鳊亚科鲂属。团头鲂肉质鲜美，营养丰富，是我国优良的淡水养殖品种。现代渔业集约化养殖的发展，引发养殖环境污染、抗生素滥用等问题[1]。研究表明，中草药能够提高动物机体的消化和吸收代谢率，促进生长发育[2-3]，调节免疫[4-6]，抗病保健[7]，改善肌肉品质[8-9]等。目前，关于中草药复方制剂对团头鲂的免疫方面的研究较少。本试验在团头鲂饵料中添加不同配伍、不同剂量的金盏花、黄芪、杜仲的提取物，评估中草药复方制剂对其脾脏、肾脏、肠道等免疫器官组织的安全性，筛选对团头鲂具有良好免疫增强效果的中草药复方制剂。1材料与方法1.1试验材料团头鲂购自海兴农苗种厂。试验分别在全价饵料配方中添加2%和4%不同的中草药复方制剂（A、B、C）。中草药复方制剂A以金盏花微粉为主，杜仲和黄芪微粉为辅；中草药复方制剂B以杜仲微粉为主，金盏花和黄芪微粉为辅；中草药复方制剂C以黄芪微粉为主，金盏花和杜仲微粉为辅。金盏花、黄芪、杜仲均购自广州清平中药材批发市场。基础饵料组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.012.T001表1基础饵料组成及营养水平项目A1组A2组B3组B4组C5组C6组D7组（对照组）原料组成豆粕28.0026.0028.0026.0028.0026.0030.00菜籽粕25.0025.0025.0025.0025.0025.0025.00小麦20.0020.0020.0020.0020.0020.0020.00DDGS12.0012.0012.0012.0012.0012.0012.00统糠1.501.501.501.501.501.501.50米糠粕2.702.702.702.702.702.702.70大豆油2.002.002.002.002.002.002.00膨润土3.003.003.003.003.003.003.00磷酸二氢钙2.702.702.702.702.702.702.70氯化胆碱0.140.140.140.140.140.140.14食盐0.300.300.300.300.300.300.30矿物质预混料0.500.500.500.500.500.500.50抗氧化剂0.010.010.010.010.010.010.01防霉剂0.050.050.050.050.050.050.05多维预混料0.100.100.100.100.100.100.10中草药复方制剂A2.004.0000000中草药复方制剂B002.004.000.0000中草药复方制剂C00002.004.000合计100.00100.00100.00100.00100.00100.00100.00营养水平粗蛋白26.6025.7426.6025.7426.6025.7427.46粗脂肪2.002.002.002.002.002.002.00赖氨酸1.001.001.001.001.001.001.00粗纤维8.008.008.008.008.008.008.00粗灰分12.0012.0012.0012.0012.0012.0012.00注：1.预混料购自清远海贝生物技术有限公司。2.营养水平均为实测值。%1.2试验设计及饲养管理1 500尾试验团头鲂放入大型养殖循环系统，暂养7 d，暂养期间投喂团头鲂基础饵料。正式试验开始，随机选取1 050尾（50.00±1.80）g的团头鲂，随机分为21个小型循环水试验系统，每个系统分配50尾。循环水的水温（18.0±1.5）℃，pH值7.2~7.6，溶氧浓度为8.3~8.6 mg/L。21个小型循环水系统随机分为7组，每组3个重复。分别A1组、A2组、B3组、B4组、C5组、C6组、D7组（对照组），投喂对应编号的复方饵料。每天7：00、12：00、18：00定时投喂，日均投饵率为3%。1.3测定指标及方法1.3.1组织切片制作与观察试验第0、14、28 d，各组随机捞取10尾团头鲂，观察记录团头鲂体表特征，称重，测量鱼体长；完整分离内脏团，称重；取脾、肾组织制作组织切片，观察。1.3.2血液采集与测定试验第7、14、21、28 d，各组取5尾团头鲂静脉采血，用于测定白细胞数量、红细胞数量、血红蛋白含量、白细胞吞噬活性。白细胞数量、红细胞数量采用血细胞计数板计数，血红蛋白含量采用改良沙利氏法检测。1.4数据统计与分析数据采用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析，采用Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1中草药复方制剂对团头鲂脾脏组织形态的影响（见图1）由图1（C0-1、C0-2）可知，试验开始前，团头鲂脾脏组织中脾红髓和脾白髓的界限清晰，脾索和淋巴细胞生发中心等均为正常形态，脾血窦数量正常，脾脏组织处于正常范畴。试验第14 d，各组团头鲂脾脏组织结构完整正常，无异常病理坏死、红细胞浸润等现象；试验第28 d，饲喂中草药复方制剂饵料的团头鲂脾脏组织结构完整正常，无异常病理坏死、红细胞浸润等现象，但对照组团头鲂的脾脏组织中出现了细胞萎缩、间质水肿现象。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.012.F001图1各组脾脏组织形态（H&E，400×）注：C0-1、C0-2为投喂前的组织形态；下图同。2.2中草药复方制剂对团头鲂肾脏组织形态的影响（见图2）由图2（C0-1、C0-2）可知，试验开始前，团头鲂肾脏组织中肾小球中毛细血管网和肾小管上皮细胞均完整正常。试验第14 d，饲喂中草药复方制剂饵料的团头鲂肾脏组织形态结构正常，对照组的部分肾小管上皮细胞萎缩，肾细胞处于病变状态；试验第28 d，A1组、A2组和对照组团头鲂均有肾小球萎缩、肾小管上皮细胞坏死脱落的现象，其中对照组最严重，其次是A1组；B3组、B4组、C5组 和C6组团头鲂肾脏组织的形态结构均完整正常。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.012.F002图2各组肾脏组织形态（H&E，400×）2.3中草药复方制剂对团头鲂肠道组织形态的影响（见图3）由图3（C0-1、C0-2）可知，试验开始前团头鲂肠道组织中上皮层、黏膜层、肌肉层和外膜层结构正常，黏膜层中肠绒毛上皮细胞、杯状细胞、中央乳糜管和腺体形态均正常。试验第14、28 d饲喂中草药复方制剂饵料的团头鲂肠道组织结构完整正常；第1 d对照组团头鲂肠道组织中肠绒毛顶端有少量上皮细胞溶解脱落，第28 d时，对照组团头鲂肠道组织中部分肠绒毛上皮细胞坏死，绒毛顶端组织细胞脱落。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.012.F003图3各组肠道组织形态（H&E，400×）2.4中草药复方制剂对团头鲂血液白细胞数量的影响（见表2）由表2可知，试验第7 d，A2组、B3组、B4组、C5组、C6组团头鲂血液中的白细胞数量均显著高于对照组（P0.05）；试验第14 d，C5组、C6组团头鲂白细胞数量均显著高于对照组（P0.05）；试验第21 d，A2组、C5组和C6组团头鲂白细胞数量均显著高于对照组（P0.05）；试验第28 d，C5组、C6组团头鲂白细胞数量最高，显著高于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.012.T002表2中草药复方制剂对团头鲂血液白细胞数量的影响组别0 d7 d14 d21 d28 dA1组64.33±0.5864.67±3.05c66.33±1.15d66.33±1.15cd66.67±2.89bcA2组63.67±1.1571.00±2.00b79.00±2.65a79.00±2.00a68.67±1.53bB3组63.67±1.5359.00±2.65d64.00±1.00d67.00±2.00c67.33±2.08bcB4组65.67±1.1574.67±2.52b73.67±1.15c68.00±2.65c70.33±2.52bC5组64.33±1.1585.67±1.53a76.33±1.15b78.00±2.00ab84.00±1.73aC6组64.67±0.5883.67±1.53a78.00±1.00ab74.33±4.04b83.67±3.21aD7组63.67±0.5864.67±1.53c61.00±1.00e62.67±1.53d64.00±2.65c注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著（P0.05）；相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。×108个/L2.5中草药复方制剂对团头鲂血液红细胞数量的影响（见表3）由表3可知，试验第7 d，C6组红细胞数量最高，显著高于对照组（P0.05）；C5组、B4组、B3组红细胞数量均显著高于对照组（P0.05）。试验第14、21和28 d时，C6组团头鲂血液中的红细胞数量最高，显著高于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.012.T003表3中草药复方制剂对团头鲂血液红细胞数量的影响组别0 d7 d14 d21 d28 dA1组13.00±0.199.67±0.58d10.67±0.57c13.00±0.93c11.00±0.80dA2组13.00±0.1910.00±0.75d10.00±0.39c13.00±0.82c13.00±1.00cB3组13.00±0.1912.00±0.72c12.00±0.91bc11.00±1.00d14.00±0.89bcB4组13.00±0.1913.00±0.87bc13.00±0.99b13.00±0.99c15.33±0.58bC5组13.00±0.1914.00±1.00b12.00±0.86bc15.00±0.92b15.00±0.38bC6组13.00±0.1918.00±0.90a20.00±0.78a19.00±0.94a17.00±1.03aD7组13.00±0.1910.00±0.59d11.00±0.93c13.00±0.91c11.00±1.01d×108个/L2.6中草药复方制剂对团头鲂血液血红蛋白含量的影响（见表4）由表4可知，试验第7 d，C6组团头鲂的血红蛋白含量最高，但与对照组差异不显著（P0.05）。试验第14 d，C6组团头鲂血液中血红蛋白含量显著高于对照组（P0.05）。试验第21 d，添加中草药复方制剂各处理组的血红蛋白含量均显著高于对照组（P0.05）。试验28 d，C6组团头鲂血红蛋白含量显著高于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.012.T004表4中草药复方制剂对团头鲂血液血红蛋白含量的影响组别0 d7 d14 d21 d28 dA1组50.00±1.0050.00±0.90b49.00±2.00c59.33±2.52b52.00±0.95bA2组50.67±0.5852.00±0.88ab50.00±1.02bc58.00±1.00bc52.00±0.79bB3组50.33±2.0851.33±1.15ab49.00±1.00c57.00±1.00c52.00±1.00bB4组50.33±1.1551.66±1.53ab51.00±1.00b61.33±2.08a51.67±0.58bC5组50.33±1.0951.67±1.09ab52.00±1.00ab62.00±2.00a52.33±0.58bC6组49.67±1.5353.00±1.03a53.00±1.03a61.00±2.02a61.33±1.53aD7组50.33±2.0951.00±1.09ab49.00±1.00c55.00±1.04d53.00±1.02bmg/L3讨论3.1中草药复方制剂对团头鲂脾脏组织的影响鱼类的脾脏是重要的造血器官和免疫器官[10]，对鱼类的生长十分重要[11-13]。林旋等[14]研究发现，在罗非鱼饵料中添加黄芪提取物，罗非鱼脾脏的发育和成熟速度均有所提高。本试验中，在团头鲂饵料中添加中草药复方制剂A、B、C，投喂28 d后团头鲂的脾脏组织完好，对照组团头鲂脾脏组织出现细胞萎缩和间质水肿现象，说明3种中草药复方制剂有助于维持团头鲂脾脏组织的正常结构，与上述报道结果相似。3.2中草药复方制剂对团头鲂肾脏组织的影响肾脏是鱼类重要的免疫器官[15-16]，具备造血、免疫、排泄等多种功能。温周瑞等[17]使用当归和杜仲等中草药提取物投喂罗非鱼30 d，结果发现，罗非鱼的肾脏系数与对照组差异不明显[18]。本试验中，使用3种中草药复方制剂连续投喂14 d，团头鲂肾脏组织形态结构均保持正常；第28 d时，添加中草药复方制剂A组和对照组团头鲂的肾脏组织均出现不同程度的肾小管上皮细胞坏死脱落的现象，而中草药复方制剂B组和C组的团头鲂肾脏组织的形态结构均完整。3.3中草药复方制剂对团头鲂肠道组织的影响硬骨鱼类的肠道内分布与免疫功能相关的黏膜相关淋巴组织，肠相关淋巴组织位于肠道黏膜层[19]，而鱼类肠道结构的完整性决定肠道能否发挥其整体作用。姜燕[20]采用黄连、乌梅等组成的中草药复方制剂投喂凡纳滨对虾30 d，虾的肠道组织无明显损伤。陈福艳等[21]采用酵母多糖和黄芪、甘草等中草药组成的复合物投喂罗非鱼，结果发现，罗非鱼的肠绒毛高度和肌层厚度均有增加。本试验中，6个试验组团头鲂肠道组织与对照组相比，其黏膜层、黏膜下层、肌层组织结构均完整、形态均正常，与Gaucher等[22]对宽齿魮脂鲤的研究结果相似。3.4中草药复方制剂对团头鲂血液生理生化指标的影响鱼体白细胞数量和活力与机体的非特异性免疫功能密切相关[23]。机体的抵抗力变弱，感染严重时，白细胞数量减少[24]。孙晓飞[25]采用墨旱莲和鸡血藤等投喂棕点石斑鱼7~14 d，棕点石斑鱼血液白细胞数量明显升高。王庆奎等[26]研究发现，茯苓多糖可增强多种免疫细胞活性。本试验中，使用含中草药复方制剂的饵料连续投喂团头鲂7~28 d均能够提高鱼体血液中的白细胞数量，其中以黄芪为主的复方制剂C的提高能力最强。红细胞是反映鱼体健康状态的指标，具有识别、黏附抗原、促进吞噬细胞吞噬、增强细胞活性等免疫活性[27-28]。本试验中，连续投喂以杜仲为主的复方制剂B（2%）和以黄芪为主的复方制剂C（2%和4%）的饵料7~28 d均能够提高团头鲂血液中红细胞数量和血红蛋白含量。韩兆红等[29]研究发现，投喂5种不同剂量的中草药提取物对团头鲂血液中血红蛋白无明显作用，与本研究结果有差异，可能是因为添加的中草药类型、剂量和试验鱼大小不同。4结论在团头鲂基础饵料中添加4%的中草药复方制剂C（以黄芪微粉为主，金盏花和杜仲微粉为辅）有助于鱼体脾、肾、肠组织保持健康状态；以金盏花、杜仲和黄芪为组分的复方制剂，对团头鲂的非特异性免疫功能均有不同程度的增强效果，其中以黄芪微粉为主，金盏花和杜仲微粉为辅复方制剂的增强效果最佳。