长期使用抗生素造成的菌群耐药问题已经引起社会的广泛重视。因此，正确使用抗生素已逐渐成为我国畜牧养殖业关注的热点[1]。苯乳酸（phenyllactic acid，PLA）作为一种新型的有机酸类抑菌物质，具有广泛的抑菌谱，能够抑制单核细胞增生李斯特氏菌生长，可以抑制食源性腐败菌、致病菌繁殖。苯乳酸对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌等多种食源性致病菌均具有较好的抑制效果[2-4]。苯乳酸能够改善畜禽的生产性能和机体免疫力，进一步提高饲料的利用率[5-10]。目前，有关苯乳酸的报道大多集中在L-苯乳酸和D型与L型混合物[11-13]，但对D-苯乳酸（D-PLA）的研究比较少见。与L-苯乳酸相比，D-苯乳酸的抑菌能力更强[14]。许多微生物，如乳酸菌、白地霉和丙酸菌等均可产生苯乳酸[15]。其中，乳酸菌是公认安全的菌株，近几年研究的热点逐渐转为乳酸菌发酵生产苯乳酸[16-17]。为丰富产D-苯乳酸菌种、获取产量更高的D-苯乳酸，本研究选取发酵食品作为筛选乳酸菌资源，通过牛津杯涂布法的初筛试验，利用HPLC检测菌种发酵液中D-苯乳酸的含量，进一步筛选得到高产D-苯乳酸的菌株，并进行发酵工艺试验，为进一步工业化生产D-苯乳酸提供参考。1材料与方法1.1材料与仪器泡菜、酸奶（购自超市）；苯乳酸标准品：D-苯乳酸标准品、L-苯乳酸标准品（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；细菌DNA提取试剂盒（美国Omega Bio-Tek公司）；MRS液体培养基、MRS固体培养基（北京索莱宝科技有限公司）。乳酸细菌培养基（MRS）：酵母粉5.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、牛肉膏10.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L、磷酸氢二钾2.0 g/L、乙酸钠5.0 g/L、吐温-80 8.0 mL/L、乙酸钠5.0 g/L、柠檬酸二铵2.0 g/L、硫酸镁0.58 g/L、硫酸锰0.25 g/L、琼脂18.0 g/L、蒸馏水1 000 mL，pH值6.2~6.4。改良MRS培养基：苯丙氨酸10 g/L、酵母粉5 g/L、牛肉膏10 g/L、葡萄糖5 g/L、磷酸氢二钾2 g/L、乙酸钠5 g/L、吐温-80 8 mL/L、磷酸氢二钾2 g/L、乙酸钠5 g/L、柠檬酸二铵2 g/L、硫酸镁0.58 g/L、硫酸锰0.25 g/L、蒸馏水1 000 mL，pH值6.2~6.4。1.2试验方法1.2.1乳酸菌的分离筛选称取适量不同口味的泡菜、酸奶分别放入三角瓶中，加入200 mL蒸馏水，30 ℃条件下180 r/min振荡24 h，取样后采用常规梯度稀释法，分别涂布于含有碳酸钙的MRS平板上，30 ℃培养48 h，挑取有碳酸钙透明圈的菌落进行镜检观察[18-19]。将单菌落划线纯化培养，4 ℃保存。1.2.2复筛种子液培养：取初筛斜面菌种1环接入200 mL MRS液体培养基中，30 ℃条件下180 r/min摇床培养24 h。将初筛菌种的种子液分别接于乳酸细菌液体培养基，30 ℃培养72 h，利用高效液相色谱法检测经过前处理的发酵液中的D-苯乳酸含量，得到高产菌株4 ℃保存[20]。样品前处理：离心初筛获得的菌株发酵液获得上清液，采用10 mol/L甲醇调pH值至2.0，乙酸乙酯抽提4次，无水硫酸钠吸附有机物质，离心10 min，旋转蒸发获得残留物，采用缓冲液重新溶解，0.2 µm滤膜过滤后，进行HPLC检测[21]。高效液相色谱条件：高效液相色谱仪型号为安捷伦1200：手性层析柱型号为Chiral-cel OJ-R，流速：0.8 mL/min；上样量：50 μL。流动相为：pH值2.0、0.2 mol/L磷酸缓冲液-甲醇-乙氰体积比为85∶1∶14的混合液，柱温：20 ℃，检测波长：210 nm。1.2.3菌株的生理生化试验观察菌落形态，乳酸菌生理生化分析。根据过氧化氢酶试验、精氨酸产氨试验、淀粉水解试验、七叶苷水解试验、石蕊牛奶试验、明胶液化试验、乙酰甲基甲醇试验（V-P试验）、H2S试验、精氨酸水解试验、葡聚糖的产生试验、脲酶的测定和碳水化合物发酵产酸试验对46株产酸菌进行生理生化特性分析。1.2.4菌株的分子生物学鉴定提取菌株的总DNA，采用通用引物进行16S rDNA进行扩增测序，测序结果使用NCBI（National Center for Biotechnology Information）的GenBank数据库进行Blast同源性比对。选取同源性较高的模式菌株的序列，采用mega5.0软件的邻接（neighborjoining，NJ）法进行系统发育树分析。1.2.5发酵工艺单因素试验以菌株LB2366发酵液产D-苯乳酸产量为指标，选择不同碳源（葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖和麦芽糖）及氮源（蛋白胨、酵母浸粉、牛肉浸粉）的添加量和底物苯丙氨酸的添加量进行试验。30 ℃、180 r/min振荡培养72 h，每个试验做3个重复。1.2.5.1碳源优化试验在添加4.0 g/L苯丙氨酸MRS培养基的基础上，考察葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖和麦芽糖时对D-苯乳酸产量的影响。1.2.5.2氮源优化试验在添加4.0 g/L苯丙氨酸MRS培养基的基础上，考察蛋白胨、酵母浸粉、牛肉浸粉及其添加量对D-苯乳酸产量的影响。1.2.5.3苯丙氨酸的最适添加量以3%的接种量分别吸取种子液接至含5、10、15、20、25 g/L苯丙氨酸的已优化碳氮源MRS液体培养基，30 ℃、180 r/min摇瓶培养48 h，确定苯丙氨酸的最适添加量。1.2.5.4最佳培养时间的确定以3% LB2366的接种量分别接至最适添加量的苯丙氨酸的已优化碳氮源MRS液体培养基中，30 ℃培养24、36、48、60、72 h。培养结束后，取菌株LB2366的发酵液前处理后取上清，0.2 μm滤膜过滤，采用HPLC测定不同时间点D-苯乳酸产量的变化。1.2.6发酵工艺正交优化试验在单因素试的基础上进行L9(34)正交试验，采用正交试验确定菌株LB2366的最优发酵工艺条件。正交试验因素水平设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.015.T001表1L9（34）正交试验因素水平设计水平A葡萄糖浓度/(g/L)B酵母粉浓度/(g/L)C苯丙氨酸浓度/(g/L)D培养时间/h1103104821541560320520721.3数据统计与分析数据采用SPSS软件进行显著性分析。2结果与分析2.1菌株筛选按照1.3.2方法进行培养从发酵食品中筛选的若干菌株，包括植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）5株，副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）4株，玉米乳杆菌（Lactobacillus zeae）1株，戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）2株，干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）1株，乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）2株，短乳杆菌（Lactobacillus brevis）2株。通过HPLC检测发酵液中D-苯乳酸含量，结果见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.015.T002表217株乳酸菌发酵液上清液D-苯乳酸含量菌种含量Lactobacillus plantarum QJ21.79Lactobacillus paracasei YLD12.46Lactobacillus paracasei YMM56.49Lactobacillus paracasei MRL36.43Lactobacillus plantarum CY46.31Lactobacillus brevis YMJ—Pediococcus pentosaceus HD26.31Lactobacillus paracasei C-157.34Lactobacillus plantarum 234835.36Lactobacillus zeae 2363—Pediococcus pentosaceus 23616.34Lactobacillus casei 231438.56Lactobacillus plantarum 23596.37Pediococcus acidilactici 2368—Pediococcus acidilactici 236738.59Lactobacillus brevis 236676.16Lactobacillus plantarum UR-363.12注：“—”表示未检出。mg/L由表2可知，17株乳酸菌中有14株可检测出不同含量的D-苯乳酸，其中Lactobacillus brevis 2366的发酵上清液中D-苯乳酸含量最高。因此，选择Lactobacillus brevis LB2366作为下一步试验所用菌株。2.2菌落形态和生理生化试验参照《伯杰细菌鉴定手册》，杆菌均为乳杆菌属。菌株LB2366的菌落形态见图1。生理生化试验结果见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.015.F001图1菌株LB2366的菌落形态10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.015.T003表3菌株LB2366的生理生化试验结果项目结果过氧化氢酶-精氨酸产氨+明胶液化-产酸+产气-运动型-淀粉水解-V-P+石蕊牛奶+脲酶-硫化氢+葡聚糖+精氨酸水解+七叶苷-注：“+”表示结果呈阳性；“-”表示结果呈阴性。由图1可知，筛选得到的乳酸菌菌落边缘整齐，无芽孢，乳白色。由表3可知，乳酸菌LB2366不能水解淀粉，能够使石蕊牛奶产酸，不能使明胶液化，V-P试验结果为阳性，能够使精氨酸产氨，能够水解七叶苷。2.3菌株LB2366 16S rDNA序列的系统发育树以LB2366提取的DNA为模板，经扩增测序得知，菌株LB2366 16S rDNA序列为961 bp。序列提交GenBank数据库进行Blast，同GenBank数据库中的序列进行相似性比对，利用软件MEGA6.06对同源性高的菌株构建系统进化树，结果见图2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.015.F002图2菌株LB2366 16S rDNA序列的系统发育树由图2可知，菌株LB2366与短乳杆菌（Lactobacillus brevis）亲缘关系最近，结合菌落及细胞形态态特征，鉴定菌株LB2366为短乳杆菌（Lactobacillus brevis），与菌种的生理生化试验鉴定方法结果一致。2.4碳源优化结果（见图3、图4）由图3可知，在发酵阶段，菌株LB2366可充分利用葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、果糖作为碳源进行菌株生长代谢产生D-苯乳酸。当葡萄糖为唯一碳源时，D-苯乳酸产量最高。因此，选择葡萄糖作为菌株LB2366发酵培养的碳源。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.015.F003图3不同碳源对D-苯乳酸产量的影响由图4可知，随着葡萄糖添加量增加，发酵液中D-苯乳酸的产量逐渐增大；当葡萄糖添加量达20 g/L时，D-苯乳酸产量最高；葡萄糖添加量逐渐大于20 g/L时，发酵液中D-苯乳酸的产量呈逐渐减少趋势，原因是继续添加葡萄糖抑制菌体生长。因此，葡萄糖的最适添加量为20 g/L。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.015.F004图4葡萄糖添加量对D-苯乳酸产量的影响2.5氮源优化结果（见图5）由图5可知，当酵母粉添加量为4 g/L时，菌株LB2366发酵液中的D-苯乳酸产量达到最大值143.62 mg/L。因此，本试验将酵母粉作为主要氮源，最适添加量为4 g/L。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.015.F005图5不同氮源及氮源添加量对D-苯乳酸产量的影响2.6苯丙氨酸的最适添加量（见图6）由图6可知，菌株LB2366发酵液中D-苯乳酸的产量随培养基中添加的苯丙氨酸浓度提高而不断增加。当苯丙氨酸添加量达15 g/L时，菌株LB2366的D-苯乳酸产量达最高值；苯丙氨酸含量高于15 g/L以上时，D-苯乳酸产量逐渐降低。因此，确定苯丙氨酸的最适添加量为15 g/L。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.015.F006图6培养基中苯丙氨酸含量对菌株D-苯乳酸产量的影响2.7最佳培养时间的确定（见图7）由图7可知，在0~60 h阶段，菌株LB2366发酵液中的D-苯乳酸的产量随着时间延长而不断提高；培养60 h时，菌株LB2366产生D-苯乳酸的量涨势最快，产量最高达121.17 mg/L；60~72 h阶段，D-苯乳酸的产量增长逐渐缓慢。因此，确定最佳培养时间为60 h。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.015.F007图7培养时间对菌株D-苯乳酸的影响2.8正交试验结果（见表4、表5）由表4、表5可知，影响因素中葡萄糖浓度、酵母粉浓度、苯丙氨酸浓度和培养时间对菌株LB2366发酵液D-苯乳酸产量具有极显著影响。4个因素的主次关系是：葡萄糖浓度酵母粉浓度苯丙氨酸浓度培养时间。最佳反应条件为A2B3C3D3，即葡萄糖15 g/L、酵母粉5 g/L、苯丙氨酸浓度20 g/L、培养时间72 h。在最佳条件下发酵培养，得出的最高D-苯乳酸产量为194.27 mg/L，比优化前的76.16 mg/L提高1.55倍。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.015.T004表4正交试验结果项目ABCDD-苯乳酸含量/(mg/L)X1X2X31111189.2482.1381.3221222110.22110.85108.1231333112.34115.81114.7842123127.53131.67144.2752231143.58153.87157.2362312137.34140.18141.3173132128.09121.37124.6783213131.65137.88134.8193321138.94143.83145.81k1102.76114.48119.54126.22k2141.89132.02129.03124.68k3134.12132.26130.19127.86R39.1317.7810.653.1810.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.015.T005表5正交试验方差分析变异来源平方和自由度均方F值P值A葡萄糖浓度4 711.34522 355.672112.4750B酵母粉浓度2 399.50521 199.75257.2840C苯丙氨酸浓度1 580.5292790.26437.7320D培养时间1 566.1092783.05437.3880误差376.9911820.9443讨论某些属种的乳酸菌可合成苯乳酸[22]。有研究从酸面团中分离到L. plantarum 21B，产苯乳酸量为56 mg/L，将分离得到的植物乳杆菌L. plantarum 21 B在小麦粉水解液中35 ℃培养36 h，产生D-苯乳酸0.009 mg/L[23]。Zhu等[24]利用分子手段来构建基因工程菌提高发酵液中苯乳酸的产量，具体为戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus）中D-乳酸脱氢酶（D-lactate dehydrogenase，D-LDH）的Try52基团被疏水基团代替，利用其在Escherichia coli BL21中过表达提高苯乳酸的产量。目前，国内外针对利用生物转化产生苯乳酸的研究是当前的热点。但因底物成本高、发酵时间长、产物浓度低，有必要对其合成机理进行深入研究。菌种的质量直接影响发酵效果，筛选高产D-苯乳酸菌株和优化发酵工艺能够进一步提高D-苯乳酸的产业化进程。4结论本研究从中国传统发酵制品中筛选得到高产D-苯乳酸的短乳杆菌LB2366（Lactobacillus brevis），D-苯乳酸的产量为76.16 mg/L。通过正交试验确定菌株LB2366产D-苯乳酸的最佳发酵条件为即葡萄糖15 g/L、酵母粉5 g/L、苯丙氨酸浓度20 g/L、培养时间72 h。最佳条件下进行发酵，D-苯乳酸产量达194.27 mg/L，比优化前76.16 mg/L提高1.55倍。未来，仍需进一步探索紫外诱变、基因工程等手段对菌株的D-乳酸脱氢酶基因进行异源表达与纯化，以期获得D-乳酸脱氢酶更好的表达量，获得更加可观的D-苯乳酸产量。