天冬糖苷散是一种可提高南美白对虾免疫能力、抗氧化及抗环境应激能力的新型中兽药散剂，主要由天门冬中提取的天门冬多糖和三七中提取的三七总皂苷按一定比例配伍而成。天门冬性甘、苦、寒，入肺、肾经，具有滋阴、润燥、清肺、降火的功效，为主药。天门冬多糖是天冬中主要活性成分之一，具有提高免疫力、抗炎、抗氧化、抗肿瘤等作用[1-3]。三七性甘、微苦、温，归肝、胃经，具有止血散瘀、消肿定痛的功效[4]，为佐使药。三七总皂苷是从三七中提取的主要效活性成分之一[5-6]，主要包含三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd等，具有抗炎[7]、抗氧化[8]和抗肿瘤[9]等作用。前期试验表明，连续饲喂28 d不同剂量的天冬糖苷散可不同程度地提高南美白对虾血淋巴中酚氧化酶、超氧化物歧化酶、酸性磷酸酶等活性；喂养试验后，进行为期72 h的急性氨应激（100 mg/L氯化铵）试验，天冬糖苷散各剂量组血淋巴中各项免疫相关酶活性可保持相对稳定，表明连续饲喂不同剂量的天冬糖苷散28 d可提高南美白对虾的免疫功能以及抵抗急性氨应激的能力[10]。此外，剂量筛选试验表明天冬糖苷散具有抗氨和亚硝酸应激的能力[11]。为更好地控制天冬糖苷散的质量，保证天冬糖苷散的应用效果，本研究参考2015年《中国兽药典》中《散剂通则》相关要求[12]，对天冬糖苷散中主要有效成分进行鉴别和含量测定，定性鉴别天冬糖苷散中的多糖，为天冬糖苷散的质量控制提供依据。1材料与方法1.1试剂与仪器天冬糖苷散（20190624，由广西普大动物保健品有限公司中试生产）；蒽酮（20190302，上海润叶生物科技有限公司）；三七对照药材（120941-201409）、三七皂苷R1（93.1%，110754-201820）、人参皂苷Rd（92.1%，111818-201603）、人参皂苷Rg1（92.4%，110703-201832）、人参皂苷Re（93.4%，110754-201827）、人参皂苷Rb1（91.2%，110704-201827）等均购自中国食品药品检定研究院；乙腈等为色谱级。试验仪器包括：e2695高效液相色谱仪（Waters公司）、ZF-1三用紫外分析仪（江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司）、G板（青岛海洋化工厂分厂）、UV-1450紫外-可见光分光光度仪（岛津企业管理有限公司）。1.2散剂相关检查参照《中国兽药典》第2015版中散剂通则中散剂相关检查方法，检查天冬糖苷散的性状、粒度、外观均匀度、水分、装量差异。1.3三七总皂苷的薄层色谱鉴别取天冬糖苷散（50 mg），甲醇定容至10 mL，超声5 min离心，取上清液为天冬糖苷散供试品；三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd甲醇定容，取0.5 g/L为对照品溶液；正丁醇萃取法萃取三七（对照药材）0.5 g制备对照药材供试品；天冬糖苷散供试品、对照药材供试品、各对照品溶液分别以3、2、3 μL点于同一硅胶G板，正丁醇∶乙酸乙酯∶水为4∶1∶5，静置1 h，上层溶液为展开剂，喷硫酸乙醇溶液（1→10），105 ℃显色，紫外光灯（365 nm）下检视。1.4多糖定性鉴别1.4.1碘-碘化钾反应分别取1 mL蒸馏水（阴性对照）、2 g/L淀粉溶液（阳性对照）、2 g/L天冬糖苷散溶液，观察分别加入碘-碘化钾溶液后的颜色变化。1.4.2茚三酮反应按照2∶1的比例将1 mL蒸馏水（阴性对照品）、0.5%甘氨酸溶液（阳性对照品）、2 g/L天冬糖苷散溶液分别与0.1%茚三酮乙醇溶液混匀，煮沸2 min观察其颜色变化。1.4.3Molish反应分别向1 mL蒸馏水（阴性对照品）、1 g/L淀粉溶液（阳性对照品）、1 g/L天冬糖苷散溶液中滴入2滴Molish试剂及1 mL浓硫酸，观察溶液界面的颜色变化。1.4.4紫外光谱分析取3 mL 0.5%天冬糖苷散溶液于紫外-可见光分光光度计中250~290 nm进行光谱扫描，观察260、280 nm处是否有吸收峰。1.5蒽酮硫酸法检测多糖含量1.5.1标准曲线精确称取葡聚糖100 mg，蒸馏水定容至1 000 mL。取试管16支，分别吸取0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.60、0.80 mL于干燥15 mL玻璃离心管内（每管2个重复），各管以蒸馏水补至1.0 mL。对照管只加蒸馏水1.0 mL（重复2次）；将所有离心管至于冰中，每管加入2 g/L蒽酮-硫酸溶液4.0 mL，离心，煮沸10 min，静置10 min，于620 nm波长测吸光值；以空白对照管调零，测定各管OD值，绘制标准曲线及回归方程。1.5.2样品总糖含量的测定取50 mg样品，蒸馏水定容至1 000 mL，吸取样品液1.0 mL（约含50 μg）天门冬多糖加入干净试管（每样重复3次），按照上述步骤操作测定光密度，以线性方程计算总糖含量。1.6高效液相色谱法检测三七皂苷含量1.6.1色谱柱条件Phenomenex Luna C18 （250.00 mm×4.60 mm×5.00 μm），流动相A为乙腈，流动相B为水，洗脱方法参考2015版《中国兽药典》，流速1 mL/min，柱温30 ℃；波长203 nm，进样量20 μL，人参皂苷Rg1和人参皂苷Re均大于1.5。色谱柱条件见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.021.T001表1色谱柱条件时间/min流动相A/%流动相B/%0~2020.080.020~3520.0~22.180.0~77.935~6022.1~48.077.9~52.060~7048.0~20.052.0~80.01.6.2对照品溶液的制备精密称取三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd标准品，采用甲醇溶液将各标准品制成不同浓度的混合标准溶液及单个溶液，4 ℃保存。1.6.3供试品制备取天冬糖苷散25 mg加甲醇定容于10 mL容量瓶，超声离心，取天冬糖苷散上清液以0.22 μm滤膜过滤。1.6.4专属性试验制备天冬糖苷散缺少三七总皂苷阴性对照品溶液并进行测定，检查方法专属性。1.6.5线性关系试验采用甲醇倍比稀释混合标准品溶液，按照上述方法进行检测，以三七皂苷R1等皂苷对照品含量和峰面积进样量为横、纵坐标分别建立线性关系曲线。1.6.6精密度试验同一混合对照品连续进样6次，根据各皂苷的峰面积计算仪器精密度。1.6.7稳定性试验于0、2、4、6、8、10 h检测同一天冬糖苷散溶液，根据峰面积和线性曲线计算天冬糖苷散中5种对照品皂苷的含量，计算方法稳定性。1.6.8重复性试验分别测定6批天冬糖苷散供试品溶液三七皂苷R1等皂苷的含量，检测该方法的重复性。1.6.9加样回收率试验称取6份天冬糖苷散（30 mg）制备供试品，分别加入适量的三七皂苷R1等皂苷对照品溶液，测定对应对照品的含量变化，计算加样回收率。1.6.10色谱柱适应性试验流动相A、B分别为乙腈和水，流速1 mL/min，柱温30 ℃，波长203 nm，洗脱方法见表2。精密吸取供试品溶液和对照品溶液各20 μL，采用不同品牌色谱柱进行测定，计算其塔板数、分离度和含量。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.021.T002表2色谱柱适应性试验色谱柱条件时间/min流动相A/%流动相B/%0~2020.080.020~3520.0~22.180.0~77.935~6022.1~48.077.9-52.060~7048.0~20.052.0-80.02结果与分析2.1三七的薄层色谱法定性鉴别（见图1、图2）由图1、图2可知，天冬糖苷散与对照药材在相同位置出现相同斑点，表明天冬糖苷散含有三七总皂苷。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.021.F001图1日光下三七薄层色谱图注：1~6分别为对照药材、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd、天冬糖苷散；图2与此同。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.021.F002图2365 nm紫外光下三七薄层色谱图2.2散剂物理性质检验天冬糖苷散颜色及性状见图3。由图3可知，本品呈淡黄色至深黄色无定形粉末，无明显色差，外观均匀。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.021.F003图3天冬糖苷散颜色及性状本品味微甜；粒度通过率为97.55%，大于95%，粒度符合要求；水分为4.2%，小于10%，符合要求。3个批次的天冬糖苷散中各取3包的平均装量差异检查结果百分比分别为99.58%、100.26%、99.59%，装量差异小于5%，符合要求。2.3多糖进行定性鉴别2.3.1碘-碘化钾反应（见图4）由图4可知，碘-碘化钾反应呈阴性，说明天冬糖苷散中不含淀粉。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.021.F004图4碘-碘化钾反应2.3.2茚三酮反应（见图5）由图5可知，茚三酮反应呈阴性，说明天冬糖苷散中不含氨基酸和蛋白质。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.021.F005图5茚三酮反应2.3.3Molish反应（见图6）由图6可知，Molish试验呈阳性紫色环，说明天冬糖苷散中含糖。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.021.F006图6Molish反应2.3.4紫外光谱分析（见图7）由图7可知，260、280 nm处无吸收峰，故样品中不含蛋白质和核酸。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.021.F007图7紫外光谱分析2.4多糖含量测定2.4.1多糖标准曲线（见图8）由图8可知，采用葡聚糖为参考物，所作的标准曲线为y=122.83x+1.884 6，R2=0.993 4。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.021.F008图8多糖标准曲线2.4.2天冬糖苷散多糖含量分别取3批样品，测得天冬糖苷散总多糖得平均含量为59.9%。2.5高效液相色谱法测三七皂苷含量2.5.1专属性试验（见图9~图11）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.021.F009图9混合标准品液相色谱图注：1~5分别为三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.021.F010图10天冬糖苷散样品溶液色谱图由图9~图11可知，天冬糖苷散供试品溶液色谱中与各对照品溶液色谱在相同的保留时间依次为三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd的色谱峰，而阴性溶液无此峰，表明天冬糖苷散中的其他成分对三七总皂苷中各组分的测定无干扰。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.021.F011图11缺三七总皂苷阴性对照图2.5.2线性回归方程及相关系数（见表3）由表3可知，R2值均大于0.999 0。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.021.T003表3线性回归方程及相关系数成分线性方程R2线性范围/μg三七皂苷R1y=5 261.4x+1 794.6R²=0.999 064.800~2.025人参皂苷Rg1y=6 506.5x+7 922.2R²=0.999 8143.200~4.475人参皂苷Rey=5 243.9x+1 659.7R²=0.999 453.100~1.659人参皂苷Rb1y=4 549.2x+2 756.6R²=1.000 0110.200~3.444人参皂苷Rdy=5 315.8x+2 697.0R²=0.999 842.300~1.3222.5.3精密度试验三七皂苷R1等皂苷的峰面积RSD分别为0.92%、1.50%、1.74%、1.32%、1.61%，表明仪器精密度良好。2.5.4日间稳定性试验三七皂苷R1等皂苷的峰面积RSD分别为1.71%、0.42%、1.60%、0.74%、0.36%，表明天冬糖苷散供试品稳定性良好。2.5.5重复性试验6批天冬糖苷散供试品含量的RSD分别为1.73%、1.83%、1.82%、1.73%、1.53%，表明重复性良好。2.5.6加样回收率试验6批天冬糖苷散加样回收率的RSD分别为1.79%、1.24%、1.72%、0.97%、1.78%，均小于2%，表明此方法稳定性良好。2.5.7方法耐用性试验（见图12）由图12可知，天冬糖苷散中三七总皂苷分离度良好，表明此方法耐用性可靠。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.021.F012图12液相色谱柱图3讨论建立合适的中兽药质量标准是控制药物质量、保证药物临床疗效的主要方式之一[13-14]。中兽药质量标准研究主要参考现行的《中国兽药典》中相关制剂以及药物的鉴定、鉴别和含量测定方法。进行天冬糖苷散质量标准研究时主要指标为总多糖含量及三七总皂苷含量。药物中总多糖含量的测定方法包括蒽酮-硫酸法、苯酚-硫酸法、地衣酚-盐酸法等[15]。万晓莹等[15]和夏文等[16]认为，蒽酮-硫酸法的测定结果是溶液中几乎所有碳水化合物的总量，而苯酚-硫酸法测定所得主要为溶液中的甲基化的糖、多聚糖等。因此，提取纯化后的多糖含量测定选用蒽酮-硫酸法更为适合。刘晓涵等[17]在比较苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法测量枸杞子中多糖含量时，认为苯酚硫酸法较为准确。张庆红等[18]对不同产地的天冬中多糖含量进行检测，认为蒽酮-硫酸法方法简便、准确、回收率高。本研究中，天冬糖苷散中主要含有经过醇碱提取后再醇沉纯化后的天门冬多糖，故采用蒽酮-硫酸法测天冬糖苷散中总多糖含量；蒽酮-硫酸法的线性方程R2为0.993 4，表明其线性较好，方法稳定，可作为天冬糖苷散的总多糖测定方法；碘-碘化钾和茚三酮反应呈阴性，Molish反应呈阳性，表明天冬糖糖苷散中无淀粉，不含氨基酸和蛋白，有多糖存在；紫外光谱分析显示，天冬糖苷散中无核酸和蛋白质存在。研究为天冬糖苷散中淀粉、氨基酸、核酸和蛋白质提供了良好的控制方法。本研究参考2015版《中国兽药典》中三七总皂苷的鉴别和含量测定方法，分别以三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd为标准品，采用高效液相色谱法，建立标准曲线，测定含量并对该方法进行重复性、稳定性、加样回收率等试验，其RSD均在5.00%范围内，表明此方法稳定可靠，可应用于天冬糖苷散中三七总皂苷的含量检测。目前，有关三七总皂苷的薄层色谱法的报道较多[19-20]。第2015版《中国兽药典》三七薄层中主要采用氯仿∶甲醇∶乙酸乙酯∶水=16∶40∶22∶10，取下层为展开剂。闫海全[20]在此基础上比较6种三七总皂苷的薄层色谱展开剂，认为展开剂正丁醇∶乙酸乙酯∶水=4∶1∶5，取上层的效果较好。本试验中，选择的对照品分别为三七对照药材、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd，取正丁醇∶乙酸乙酯∶水=4∶1∶5，取上层为展开剂，进行天冬糖苷散中三七总皂苷的薄层色谱鉴定，结果显示，天冬糖苷散与对照药材和对照品在薄层图中相同位置均有相同、清晰的斑点，且分离度较好，证明其方法稳定可靠。4结论本试验建立的天冬糖苷散质量标准中的含量检测、主要成分鉴别和鉴定等方法稳定性好、重复性高、操作性强、简便耐用，可应用于天冬糖苷散的质量控制。