团头鲂（Megalobrama amblycephala）是我国主要的淡水养殖品种之一。近年来，在鱼粉等蛋白饲料原料短缺且价格上涨、养殖水域污染日益加重的情况下，团头鲂养殖业受到冲击，年产量近逐渐下降[1]。因此，研究团头鲂绿色高效饲料对其养殖业健康发展具有重要意义。碳水化合物与脂肪、蛋白质并称为三大供能物质。与脂肪和蛋白质相比，碳水化合物来源广泛、价格低廉，在饲料中加入碳水化合物可节约鱼类对蛋白质的消耗。碳水化合物具有良好的黏结性，有助颗粒饲料成型，可提高饲料在水中的稳定性。但是，与哺乳动物相比，鱼类对碳水化合物的利用率较低，曾被认为是天生的糖尿病患者[2]。团头鲂饵料中碳水化合物含量不宜超过34%，摄食高糖饵料不利于团头鲂生长及肝脏健康，可造成肌酸通路紊乱[3]。研究表明，高糖饵料中补加甜菜碱可缓解高糖对鱼体生长性状及肝脏健康的不利影响，改善肠道菌群[4]；经团头鲂生长性状、肝脏组织形态、肠道菌群分析和相关代谢物含量变化综合分析，表明甜菜碱最适添加量为1.20%[5]。目前，高糖饵料中补充肌酸对鱼类影响的相关研究还未见报道。因此，本研究在高糖饵料添加1.2%甜菜碱的基础上研究饵料补充肌酸对团头鲂的生长性能、肠道菌群及血清氨基酸含量的影响，以期为团头鲂复合饵料添加剂的研究提供参考。1材料与方法1.1试验动物180尾初重（11.88±0.46）g体格健壮、大小均一的团头鲂购自湖北省黄冈市幸福村鱼苗繁殖基地。驯养2 w后，随机分为2组，每组3个重复，每个重复30尾，以重复为单位养殖（300 L塑料桶）。1.2试验设计共设计2组试验饵料，对照组和试验组的碳水化合物、甜菜碱及肌酸的水平分别设置如下：对照组（高糖+甜菜碱组）饵料中含39.76%碳水化合物+1.20%甜菜碱；试验组（高糖+甜菜碱+肌酸组）饵料中含39.29%碳水化合物+1.20%甜菜碱+0.50%肌酸。甜菜碱为无水甜菜碱，纯度大于98.0%；肌酸为一水肌酸，纯度大于99.0%。基础饵料组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.010.T001表1基础饵料组成及营养水平（风干基础）项目对照组试验组原料组成鱼粉8.008.00豆粕31.0031.00棉粕10.0010.00菜粕9.009.00次粉31.6031.60麦麸1.501.50豆油2.002.00赖氨酸0.400.40蛋氨酸0.100.10磷酸二氢钙1.001.00氯化胆碱0.200.20羧甲基纤维素1.001.00预混料1.001.00甜菜碱1.201.20肌酸0.000.50沸石粉2.001.50合计100.00100.00营养水平水分8.017.78粗蛋白质33.0133.67粗脂肪9.9610.17粗灰分9.759.31碳水化合物39.7639.29注：1.预混料购自北京渔经生物科技有限公司。2.营养水平均为实测值。%1.3饲养管理饲养期间每天投喂2次（8：00、16：00），养殖周期90 d。水温24~26 ℃，溶解氧5 mg/L，pH值7.2~7.8，氨氮0.01 mg/L。1.4测定指标及方法养殖试验结束后，停喂12 h，每缸鱼采用浓度为100 mg/L的MS-222麻醉，称量总重。每缸随机挑选12尾鱼，测定体长、体高和体重。采用EDTA润湿的注射器从尾静脉采血，静置6~8 h，4 ℃条件下3 000 r/min离心10 min，-80 ℃保存。鱼解剖分离肝脏，称量并分成2份：一份应用于组织切片分析（4%的多聚甲醛固定）；另一份-80 °C保存，应用于荧光定量分析试验（qPCR）。收集鱼肠道内容物，提取肠道微生物以备后续肠道微生物多样性及物种组成分析。1.4.1生长性能增重率(WGR)=(末重-初重)/初重×100% (1)特定生长率(SGR)=100×(ln末重-ln初重)/饲养天数(2)饲料系数(F/G)=每缸投喂饲料总量/每缸鱼体总增重量(3)肥满度(CF)=体重/体长3×100%(4)肝体比(HSI)=肝指数/体湿重×100%(4)1.4.2饲料常规营养成分的测定水分含量的测定参照GB/T 5009.3—2010的干燥恒重法；灰分含量的测定参照GB/T 5009.4—2010的灼烧重量法；蛋白质含量的测定参照GB/T 5009.5—2010的全量凯氏定氮法；粗脂肪含量的测定参照GB/T 5009.6—2010的索氏抽提法。1.4.3肝脏HE切片分析部分肝脏经固定脱水，石蜡包埋。肝脏组织通过苏木精-伊红染色法（HE染色）制备病理切片（厚度3 μm），白光显微镜（Olympus）200×视野下观察肝细胞的形态。1.4.4血清氨基酸含量分析采用全自动氨基酸分析仪A300（Membra Pure GmbH）测定血清氨基酸含量。前处理参照王凡[5]的操作流程。1.4.5qPCR分析取肝脏样品100 mg匀浆，使用Trizol法提取总RNA，合成cDNA，检测相关酶的基因表达，参照徐佳[4]和王凡[5]操作流程。β-actin（F：5'-CGGACAGGTCATCACCATTG-3'；R：5'-CGCAAGACTCCATACCCAAGA-3'）在团头鲂高糖及添加甜菜碱的饵料研究中均表达稳定[4-6]，选定作为内参基因进行qPCR试验。肌酸激酶（creatine kinase，CK）、肌氨酸脱氢酶（sarcosine dehydrogenase，Sardh）和苏氨酸醛缩酶（threonine aldolase1，Tha1）的引物序列见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.010.T002表2qPCR引物信息引物引物序列（5'→3'）产物长度/bpCKTCCCAAAGCCTCAACGG161TGAACCCAGACAACCTCCTha1GGGAGCGTGGGTAGTGT113AGCAGGCGTCCATTCTGSardhTCTGCCTGTCTACAACGC156GCAAGTCCTGCCTCAAGT1.4.6肠道微生物菌群分析采用溴化十六烷基三甲铵（CTAB）提取法获得鱼肠道微生物的总DNA。采用Nano Drop 2000分光光度计测定总DNA的浓度和纯度，采用引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'）及806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）对16S rRNA基因V3~V4区进行序列扩增。选择目的条带大小正确的2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物进行上机测序，测序系统采用Illumina Miseq测序平台（San Diego），测序公司为上海美吉生物医药科技有限责任公司。1.5数据统计与分析数据使用SPSS 26.0软件进行分析，采用t检验法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1高糖饵料添加肌酸对团头鲂生长性能的影响（见表3）由表3可知，试验组和对照组团头鲂的增重率、特定生长率、肝体比以及肥满度无显著差异（P0.05），但试验组团头鲂的饵料系数显著低于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.010.T003表3高糖饵料添加肌酸对团头鲂生长性能的影响项目初重/g末重/g增重率/%特定生长率/(%/d)饵料系数肝体比/%肥满度/(g/cm3)P值0.3960.2060.8330.8360.0340.6640.853对照组11.71±0.4021.86±0.1386.86±7.500.67±0.042.77±0.09a1.10±0.111.98±0.13试验组12.06±0.2322.77±0.6888.87±9.270.68±0.052.53±0.10b1.11±0.111.98±0.15注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.2高糖饵料添加肌酸对团头鲂肝脏组织的影响（见图1）由图1可知，与对照组相比，试验组团头鲂肝脏组织并未出现细胞内脂肪含量增加、细胞核偏移或消失、细胞膜破裂等现象加剧的情况；两组切片中正常细胞形态的肝细胞居多。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.010.F001图1肝脏H&E组织切片视野图（200×）（a）对照组 （b）试验组注：a为肝细胞肿大，脂肪堆积；b为形状规则的肝细胞；c为细胞核缺失的肝细胞。2.3高糖饵料添加肌酸对团头鲂肠道微生物的影响2.3.1微生物群落的Alpha多样性分析（见表4）由表4可知，对照组和试验组团头鲂肠道菌群的Simpson指数、Shannon指数和Ace指数均无显著差异（P0.05）。Ace指数表示菌群丰富度，数值越大，菌群丰富度越高；Simpson指数和Shannon指数表示菌群多样性，指数越大，群落多样性越高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.010.T004表4微生物群落的Alpha多样性分析项目Shannon指数Simpson指数Ace指数P值0.3740.4300.481对照组1.99±0.110.28±0.05152.16±22.84试验组1.89±0.110.25±0.03135.34±29.822.3.2基于门水平的微生物群落结构分析（见表5）由表5可知，两组团头鲂肠道中的拟杆菌门占比无显著差异（P0.05）。试验组团头鲂肠道中梭杆菌门和变形菌门的占比均显著低于对照组（P0.05）；厚壁菌门占比显著高于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.010.T005表5基于门水平的微生物群落结构分析项目梭杆菌厚壁菌变形菌门拟杆菌P值0.0290.0000.0360.730对照组/%56.65±5.87a13.78±1.40b13.90±4.82a14.24±4.90试验组/%43.56±3.36b37.86±3.05a4.94±1.30b12.66±5.542.3.3基于属水平的微生物群落结构分析（见表6）由表6可知，两组团头鲂肠道中拟杆菌属占比无显著差异（P0.05）。与对照组相比，试验组团头鲂肠道中鲸杆菌属、气单胞菌属和弧菌属占比显著降低（P0.05），ZOR0006和丹毒丝菌科未命名属占比显著升高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.010.T006表6基于属水平的微生物群落结构分析项目鲸杆菌属ZOR0006拟杆菌属气单胞菌属丹毒丝菌科未命名属弧菌P值0.0290.0000.6430.0140.0460.011对照组/%56.65±5.87a6.74±1.26b13.07±4.128.36±2.28a3.78±0.72b2.38±0.49a试验组/%43.56±3.36b29.86±2.94a11.11±5.382.67±0.66b5.19±0.46a0.78±0.39b2.4高糖饵料添加肌酸对团头鲂血清氨基酸含量的影响（见图2）由图2可知，与对照组相比，试验组团头鲂的血清苏氨酸（Thr）含量显著上升（P0.05），肌氨酸（Sar）和甘氨酸（Gly）含量差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.010.F002图2高糖饵料添加肌酸对团头鲂血清氨基酸含量的影响注：不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下图同。2.5高糖饵料添加肌酸对团头鲂酶基因表达的影响（见图3）由图3可知，与对照组相比，试验组团头鲂CK和Tha1 mRNA的表达量均显著上升（P0.05），Sardh表达量无显著差异（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.010.F003图3高糖饵料添加肌酸对团头鲂酶基因表达的影响3讨论3.1高糖饵料添加肌酸对团头鲂生长性能的影响肌酸又称N-甲基胍乙酸或肌肉素，是一种含氮有机酸，属于氨基酸衍生物，可以改善人类健康、提高动物的生长性能。研究表明，眼斑拟石首鱼（Sciaenops ocellatus）的饵料中添加0.5%~4.0%的肌酸，增重率、饲料效率和成活率与未添加肌酸的饲料相比差异显著，肌酸可改善眼斑拟石首鱼在不同盐度环境中的生长性能[7]。Stiyes等[8]研究发现，2%的肌酸对眼斑拟石首鱼的生长性状无显著性影响。在对金头鲷（Sparus aurata）的研究中同样发现，2%、5%和8%的一水肌酸对金头鲷的增重率无显著影响[9]。因此，肌酸对鱼类生长性能的影响尚无统一结论，原因可能与添加量和品种有关。本研究预试验发现，含1.20%甜菜碱的高糖饲料添加0.5%~2.0%的肌酸对团头鲂的生长性能无显著性影响。因此，设置肌酸添加量为0.50%。本研究中，添加0.5%的肌酸并未显著提高团头鲂的WGR、CF、SGR和HSI，但却显著降低了饵料系数。3.2高糖饵料添加肌酸对团头鲂肝脏组织的影响高糖饵料可导致团头鲂肝脏损伤，如肝细胞内脂肪堆积严重、大量细胞核偏移消失、细胞膜破裂[4-5]。研究表明，高脂饵料中补充2%肌酸可显著减少小鼠棕色脂肪组织、皮下白色脂肪组织、内脏白色脂肪组织中的脂滴体积[10]。本试验中，对照组和试验组团头鲂肝脏组织切片无显著差异，两者均表现形状规则的细胞核数量居多，也未出现大量脂肪堆积的现象。结果表明，含有1.20%甜菜碱的高糖饵料中补充0.50%的肌酸对团头鲂肝脏健康无不利影响。3.3高糖饵料添加肌酸对团头鲂肠道微生物的影响鱼类肠道微生物菌群丰富，这些微生物常被称为鱼类的第二基因组，对鱼类健康具有重要作用[11]。肠道微生物的组成受宿主因素、环境因素和微生物因素共同影响，不同动物肠道内的优势菌群也不同[12]。健康动物肠道通常表现为变形菌门丰度低和厚壁菌门丰度高[13-15]。刘寒等[16]研究表明，高糖高脂饵料导致团头鲂肠道内梭杆菌门和变形菌门的丰度增加，厚壁菌门和拟杆菌门的丰度减少。刘晓贞[17]研究发现，与普通饮食相比，高脂饮食组的小鼠厚壁菌门相对丰度减少，变形菌门丰度明显增加。本研究中，试验组中厚壁菌门占比显著高于对照组，梭杆菌门和变形菌门占比显著低于对照组，与上述报道相符。研究表明，本试验中添加肌酸组的团头鲂肠道微生物菌群在门水平上呈现更健康的状态。气单胞菌属和弧菌属为条件致病菌，是水产动物的常见病原菌，不利于鱼虾贝类生长，高浓度的哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）和副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）可直接导致水产养殖物种死亡[18-19]。研究表明，与脂肪水平较低组相比，高脂饵料饲养的鱼类肠道内气单胞菌属丰度提高[20]。在一些研究中，鲸杆菌属被认为是健康鱼体的优势菌[21]。但是，也有研究表明，高脂饲料导致鱼体肠道微生物多样性降低，肠道内鲸杆菌属菌群显著增多[22-23]。丹毒丝菌科与鱼类对多糖的利用有关，丹毒丝菌科未命名属水平的升高可能说明鱼类对植物性饵料更适应[24]。本试验中，试验组团头鲂肠道中的气单胞菌属、弧菌属和鲸杆菌属占比显著低于对照组，说明试验组的肠道微生物在属水平上呈现更健康的状态。3.4肌酸通过苏氨酸醛缩酶增加团头鲂血清氨基酸含量的影响外源性肌酸经过消化吸收在肝脏合成为内源性肌酸，通过肌酸转运蛋白进入其他组织进行代谢[25]。肌酸可通过非酶促反应直接生成肌酸酐，或者在肌酸激酶的作用下生成磷酸肌酸，再生成肌酸酐（见图4）[26]。肌酸和肌酸前体（胍基乙酸）的补充可导致肌酸激酶（CK）的含量显著性升高[27]，CK水平的升高是胍基乙酸增加罗非鱼对能源利用的重要原因[28]。肌氨酸是肌酸代谢通路的中间体，肌酸可生成肌酸酐后进一步代谢生成肌氨酸[29-30]。本试验中，添加肌酸使试验组CK的表达量显著增加，但肌酸通路中肌酸和肌酸酐的代谢物肌氨酸含量并未显著提高，可能是由于肌氨酸仅为肌酸代谢通路的中间体，不是终产物，通过CK增加的磷酸肌酸、肌酸酐及肌氨酸可进一步生成甘氨酸和苏氨酸，但自身在血清中的浓度虽有增加趋势但差异不显著。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.010.F004图4肌酸增加团头鲂体内苏氨酸含量的路径肌氨酸在肌氨酸脱氢酶（Sardh）的作用下，可生成甘氨酸[4]，饲料中添加一水肌酸可提高育肥猪血浆中甘氨酸含量[31]。本试验中，外源性肌酸并未显著提高甘氨酸含量和Sardh的mRMA表达，但苏氨酸醛缩酶Tha1 mRNA表达和血清中苏氨酸的含量却显著升高。Tha1的主要作用是将苏氨酸降解为甘氨酸和乙醛[32]，高浓度苏氨酸和低浓度甘氨酸同时作用可使Tha1活性提高[33]，但Tha1也可反向催化甘氨酸和乙醛生成苏氨酸[34-35]。结合前文肌氨酸和Sardh的结果可知，添加的外源性肌酸在肌酸通路中的肌氨酸和甘氨酸处并未过度累积，而是通过Tha1将大部分肌酸转化为苏氨酸。因此，外源性肌酸可通过增强Tha1 mRNA表达提高血清中苏氨酸的含量。4结论本试验研究表明，在含有1.20%甜菜碱的高糖饵料中补充0.50%的肌酸可提高团头鲂的饵料利用率，改善其肠道微生物组成及健康，通过甘氨酸-苏氨酸代谢中的Tha1增加血清苏氨酸的含量。