博落回系罂粟科博落回属多年生草本植物，具有抗炎[1]、抗菌[2]、抗癌[3]、抗病毒[4]、杀虫[5]、改善肝功能、增强免疫力等[6]药理作用。近年来，博落回在临床用药、农业生产、动物生产等领域取得显著成果。作为我国首个二类新兽药，博落回被农业农村部批准用于饲料添加剂。博落回可促进动物生长，增强动物免疫力，预防动物疾病，提高动物产量。博落回作为天然药用植物，其主要活性成分是生物碱[7]。目前，已报道的博落回生物碱有70种以上[7-8]，可能还有一些未知生物碱尚未被发现。优化博落回生物碱类的提取工艺可以提高博落回资源利用率。目前，生物碱提取方法主要包括溶剂提取法、超声提取法、半仿生提取法、微波萃取法、超临界流体法、大孔树脂吸附法等[9]。生物碱分离方法主要包括柱层析法[10]、色谱法[11-12]、分子印迹技术[13]、膜分离技术[9,14]等。测定中药材中总生物碱含量的方法主要包括化学分析法、分光光度法、酸性染料比色法、雷氏盐比色法、异羟肟酸铁比色法等。本研究采用分光光度法结合酸性染料比色法，用于测定博落回生物碱含量，重点研究方法的灵敏度与有效性，采用响应面法优化博落回生物碱的提取工艺，为节约博落回资源与后续博落回生物碱全成分解析奠定基础。1材料与方法1.1试验仪器DF-01S型集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限责任公司）、AL204电子分析天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）、SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）、PXSJ-226型离子计（上海仪电科学仪器股份有限公司）、KQ2200型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、TD5Z型离心机（盐城市凯特实验仪器有限公司）、UV2800型双光束紫外可见分光光度计（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）、多功能粉碎机（永康市金穗机械制造厂）。1.2材料与试剂博落回全株（采自湖南长沙黑麋峰），经湖南农业大学谢红旗教授鉴定确认；盐酸（38.0%，株洲市星空化玻有限责任公司）；盐酸罂粟碱（99.9%，中国食品药品检定研究所）；甲醇、溴甲酚绿、溴麝香草酚蓝、甲基橙、邻苯二甲酸氢钾、二氯甲烷均为分析纯。1.3试验方法1.3.1总生物碱含量测定1.3.1.1供试样品溶液的制备称取博落回生药材粉末（40目）4.00 g，加入盐酸溶液，回流提取3次，抽滤，收集滤液；向滤液中加入30%的NaOH溶液，调节pH值至9~10，静置24 h，离心收集沉淀物，干燥得到生物碱提取物。使用甲醇溶解生物碱提取物，取上清液进行生物碱含量测定。1.3.1.2溶液的配制（1）对照品溶液：称取10 mg罂粟碱，加入适量甲醇溶解，定容至100 mL，配成0.1 g/L的罂粟碱溶液。（2）0.5 g/L溴甲酚绿溶液：称取0.1 g溴甲酚绿，加入3 mL 0.05 mol/L氢氧化钠溶液超声溶解，用蒸馏水定容至200 mL，配成0.5 g/L溴甲酚绿溶液。0.5 g/L溴麝香草酚蓝、0.5 g/L甲基橙溶液配制方法同上。（3）邻苯二甲酸氢钾-盐酸缓冲液（pH值3.4）：称取20.42 g邻苯二甲酸氢钾，配制0.1 mol/L的溶液，取50 mL 0.1 mol/L邻苯二甲酸氢钾溶液与10.4 mL 0.1 mol/L盐酸溶液混合，用蒸馏水定容至100 mL，配制邻苯二甲酸氢钾-盐酸缓冲液。（4）邻苯二甲酸氢钾-盐酸缓冲液（pH值3.0）：50 mL 0.1 mol/L邻苯二甲酸氢钾溶液加入22.3 mL 0.1 mol/L盐酸溶液，使用蒸馏水定容至100 mL，配制邻苯二甲酸氢钾-盐酸缓冲液。1.3.1.3溴甲酚绿分光光度法显色体系的确定酸性染料显色剂的选择及其显色体系最大吸收波长的确定。向分液漏斗中加入一定量的供试品，依次加入2 mL pH值3.0的邻苯二甲酸氢钾-盐酸溶液与2 mL溴甲酚绿（0.5 g/L），振荡混匀，加入一定量二氯甲烷，萃取3次，合并有机层。以二氯甲烷为空白，有机层于200~800 nm之间进行全波长扫描。分别将溴麝香草酚蓝、甲基橙显色剂替换溴甲酚绿，重复上述操作。在确定显色剂种类和最大吸收波长的基础上，使用控制变量法考察缓冲液种类、缓冲液pH值、缓冲液用量、酸性染料用量、振荡时间、萃取剂用量、静置时间、脱水剂用量对待测有机液吸光度的影响。1.3.1.4标准曲线的绘制分别取0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL 0.1 g/L的罂粟碱于分液漏斗中，依次加入7 mL pH值3.4的邻苯二甲酸氢钾-盐酸缓冲溶液与4 mL溴甲酚绿（0.5 g/L），振荡摇匀，加入6 mL二氯甲烷，萃取3次，合并有机层。经适量无水硫酸钠脱水，以二氯甲烷为空白，在412 nm波长下测定吸光度，绘制生物碱浓度与吸光度的标准曲线。1.3.1.5供试样品生物碱含量测定吸取适量样品溶液于分液漏斗中，操作同1.3.1.4，以二氯甲烷为空白，在412 nm波长下测定吸光度，计算样品中生物碱含量。1.3.1.6精密度试验准确吸取供试样品0.2 mL 5份，在1.3.1.3中得到的最优条件下进行显色及吸光度测定，计算结果的RSD值。1.3.1.7稳定性试验为保证试验顺利进行，将供试样品进行酸性染料显色后，每0.5 h取样1次，于6 h内测定吸光度，计算结果的RSD值。1.3.1.8重复性试验精密称取4.00 g同批次博落回粉末5份，分别按1.3.1.1制得供试样品溶液，对其进行酸性染料显色后，测定吸光度值，计算结果的RSD值。1.3.2生物碱的单因素试验以总生物碱得率为考察指标，将提取时间2.0 h，提取温度85 ℃，盐酸浓度0.5 mol/L，液料比12 mL/g确定为基本设置。然后依次对其中的某个因素进行单因素试验。提取时间调整为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h；提取温度调整为70、75、80、85、90 ℃；盐酸浓度调整为0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mol/L；液料比调整为8、10、12、14、16 mL/g。各因素的提取次数均为3次，考察各单因素对总生物碱得率的影响，确定各因素的合适取值。总生物碱得率(mg/g)=总生物碱质量/生药材质量(1)1.3.3提取工艺的响应面优化试验根据单因素试验结果，采用Box-Behnken曲面法设计响应面试验，选取提取时间1~2 h、提取温度75~85 ℃、盐酸浓度0.1~0.5 mol/L、液料比12~16 mL/g。响应面试验因素水平设计见表1。采用酸性染料比色法结合分光光度法测定提取物中生物碱含量，以总生物碱得率为指标，确定提取法的最佳工艺组合。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.014.T001表1响应面因素水平设计水平A提取时间/hB提取温度/℃C盐酸浓度/(mol/L)D液料比/(mL/g)-11.0750.11201.5800.31412.0850.5162结果与分析2.1溴甲酚绿分光光度法显色体系2.1.1酸性染料显色剂种类和最大吸收波长的确定以二氯甲烷作空白，分别以溴甲酚绿、溴麝香草酚蓝、甲基橙为显色剂，与获得的博落回生物碱反应后，对显色体系有机层进行分光光度扫描。3种酸性染料与博落回生物碱反应配合物的紫外-可见吸收光谱见图1。由图1可知，对同一批提取获得的博落回生物碱样品，样品浓度相同情况下，以甲基橙为显色剂时，形成的有色配合物在300~500 nm的吸光度过小，因而灵敏度不高；以溴麝香草酚蓝为显色剂时，其反应配合物的吸光度最大，灵敏度最高。但是，为避免后期出现样品显色体系吸光度大于1的情况，为保证较宽的线性范围，不采用溴麝香草酚蓝。因而，本研究选择以溴甲酚绿作为显色剂，其显色体系可见光区的最大吸收波长为412 nm。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.014.F001图13种酸性染料与博落回生物碱反应配合物的紫外-可见吸收光谱2.1.2显色条件单因素试验结果在最大吸收波长412 nm处，取0.8 g/L博落回总生物碱0.4 mL，考察缓冲液种类、缓冲液pH值、缓冲液用量、酸性染料用量、振荡时间、萃取次数、萃取剂用量、静置时间、脱水剂用量对吸光度的影响。各因素对吸光度的影响见图2。由图2可知，对于0.32 mg博落回总生物碱，可以采用7 mL邻苯二甲酸氢钾-盐酸缓冲液调节pH值为3.4，与4 mL的0.5 g/L溴甲酚绿振荡反应3 min，分别使用5 mL二氯甲烷萃取3次，合并萃取液，静置25 min，使用0.5 g无水硫酸钠干燥，测定有机层在412 nm波长处的吸光度。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.014.F002图2各因素对吸光度的影响2.2方法的精密度、稳定性、重复性2.2.1精密度经试验测得5份相同样品的吸光度分别为：0.069 9、0.070 7、0.071 4、0.070 3、0.070 7，RSD为0.77%（小于2.00%），说明溴甲酚绿分光光度法的精密度较高。2.2.2稳定性经试验测得供试品在6 h内的吸光度的RSD为1.80%（小于2.00%），表明样品在6 h内的稳定性良好。因此，溴甲酚绿分光光度法能够进行生物碱含量测定以及后续响应面试验中生物碱含量测定。2.2.3重复性经试验测得5个样品的吸光度值依次为：0.073 7、0.073 4、0.073 6、0.073 8、0.074 2，RSD为0.40%（小于2.00%），说明溴甲酚绿分光光度法的重复性较好。2.3标准曲线通过溴甲酚绿分光光度法测定对照品的数据，绘制生物碱浓度与吸光度的标准曲线，见图3。由图3可知，对照品溶液中生物碱含量在0.000 8~0.008 0 g/L的范围内线性良好，曲线方程为y=40.483x+0.019 7，R2=0.999 3。该线性方程适宜，可用于后续生物碱含量计算。与王花[15]提出的方法相比，本试验检测生物碱的线性范围宽，所使用的萃取剂毒性略低。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.014.F003图3生物碱浓度与吸光度标准曲线2.4单因素试验结果2.4.1提取时间对总生物碱得率的影响（见图4）由图4可知，提取时间低于1.5 h，总生物碱得率由18.55 mg/g增至24.16 mg/g；提取时间超过1.5 h，总生物碱得率有所下降。原因可能是提取时间不够时，博落回中生物碱未得到充分提取，但当提取时间过长时，部分生物碱出现氧化或分解，使得总生物碱得率有所下降。因此，确定最佳提取时间为1.5 h。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.014.F004图4提取时间对总生物碱得率的影响2.4.2提取温度对总生物碱得率的影响（见图5）由图5可知，提取温度低于75 ℃时，总生物碱得率由15.27 mg/g增至41.62 mg/g；提取温度高于75 ℃时，总生物碱得率反而下降。研究表明，适宜的温度有利于总生物碱溶出，高温使溶出物中的不耐热或易挥发成分分解或散失。因此，确定最佳提取温度为75 ℃。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.014.F005图5提取温度对总生物碱得率的影响2.4.3盐酸浓度对总生物碱得率的影响（见图6）由图6可知，随盐酸浓度的增加，总生物碱得率由15.20 mg/g降至7.98 mg/g，而后逐渐趋于平稳。盐酸浓度在0.1 mol/L时，总生物碱得率最大。因此，确定盐酸浓度为0.1 mol/L。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.014.F006图6盐酸浓度对总生物碱得率的影响2.4.4液料比对总生物碱得率的影响（见图7）由图7可知，在液料比研究范围内，总生物碱得率由12.78 mg/g增至15.93 mg/g。液料比为16 mL/g时，总生物碱得率最高。因此，确定最佳液料比为16 mL/g。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.014.F007图7液料比对总生物碱得率的影响2.5响应面优化试验结果由Box-Behnken设计原理得到以生物碱得率为响应值的4因素3水平响应面试验，响应面优化试验结果见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.014.T002表2响应面试验设计及结果试验编号ABCD生物碱得率/(mg/g)11.5750.31624.5521.5800.31427.0832.0850.3149.9941.5800.31427.9352.0800.31213.9461.0800.11414.8672.0800.11417.7981.5750.31219.6991.0850.31417.06101.0800.51410.70111.5800.5167.09121.0800.31210.42131.5800.51213.73142.0800.5148.04152.0750.31424.30161.5850.5149.90171.5800.1129.09182.0800.31612.40191.5800.31427.22201.5800.11624.61211.5800.31427.22221.5850.31214.37231.5750.51418.14241.5850.31613.66251.5800.31427.21261.0750.31419.14271.5850.11416.92281.0800.31617.69291.5750.11424.372.6试验模型及方差分析采用Design-Expert 10.0.7软件对表2数据进行回归拟合，以提取时间、提取温度、盐酸浓度、液料比为变量，总生物碱得率为响应值（Y），得到各因素与生物碱得率之间的二次回归方程：Y=27.33-0.28A-4.02B-3.34C+1.56D-3.06AB-1.40AC-2.20AD-0.20BC-1.39BD-5.54CD-7.14A2-2.67B2-7.28C2-6.53D2。对该模型进行方差分析及显著性检验，结果见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.014.T003表3响应面试验方差分析方差来源平方和自由度均方F值P值显著性模型1 245.031488.93279.990.000 1**A0.9710.973.050.102 6B194.331194.33611.830.000 1**C133.601133.60420.630.000 1**D29.33129.3392.340.000 1**AB37.39137.39117.730.000 1**AC7.8117.8124.600.000 2**AD19.40119.4061.090.000 1**BC0.1610.160.490.494 9BD7.7617.7624.420.000 2**CD122.771122.77386.520.000 1**A2331.001331.001 042.150.000 1**B246.36146.36145.970.000 1**C2343.751343.751 082.280.000 1**D2276.571276.57870.760.000 1**残差4.45140.32失拟项3.99100.403.460.121 6纯误差0.4640.12总和1 249.4728注：*表示影响显著（P0.05）；**表示影响极显著（P0.01）。由表3可知，模型的F值为279.99，P0.000 1，表明该模型极显著。模型决定系数R2为0.996 4，模型校正决定系数R2为0.992 9，变异系数为3.21（小于10.00%），说明该模型的拟合度高，能够解释99.29%响应值变化，具有一定的可信度。4个因素对试验结果的影响顺序为：提取温度盐酸浓度液料比提取时间。试验影响因素的显著性检验表明，提取时间与提取温度、提取时间与盐酸浓度、提取时间与液料比、提取温度与液料比、盐酸浓度与液料比的交互作用极显著，提取温度与盐酸浓度的交互作用无显著影响。该模型失拟项不显著（P0.05），表明该回归模型对试验结果拟合较好，故可用该模型分析试验结果，并确定博落回生物碱类的酸水提取最佳工艺。2.7响应面交互作用分析10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.014.F008各因素间的交互作用对生物碱得率的影响见图8。由图8可知，提取温度、盐酸浓度、液料比对生物碱得率的影响极显著，提取时间的影响不显著，提取温度与盐酸浓度之间交互作用的影响不显著。本研究中，最佳提取工艺为：提取时间1.58 h、提取温度75.39 ℃、盐酸浓度0.23 mol/L、液料比14.69 mL/g。此时，生物碱得率为30.037 mg/g。本研究采用酸水法提取博落回生物碱，在最优条件下的平均生物碱得率与范家佑等[16]的研究结果相当，但比陶志杰等[17]采用的超声辅助提取工艺得到的结果高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.014.F009图8各因素间的交互作用对生物碱得率的影响2.8最佳工艺的试验验证为方便操作，结合实际情况，将最佳工艺条件修正为：提取时间1.6 h、提取温度75 ℃、盐酸浓度0.2 mol/L、液料比15 mL/g。在此条件下，进行3次平行试验，生物碱平均得率为30.34 mg/g，与理论预测值的相对误差为0.99%，两者非常吻合，说明该模型能够较真实地反应各因素对博落回生物碱得率的影响。3结论溴甲酚绿分光光度法测定博落回总生物碱的检测条件为：对于0.4 mL 0.8 mg/mL的生物碱试样，采用7 mL邻苯二甲酸氢钾-盐酸缓冲液调pH值至3.4后，与4 mL的0.5 g/L溴甲酚绿振荡反应3 min，分别采用5 mL二氯甲烷萃取3次，合并萃取液静置25 min，采用0.5 g无水硫酸钠干燥，测定有机层在412 nm波长处的吸光度。通过单因素试验和响应面分析对博落回生物碱提取工艺进行优化，经试验验证确定最佳提取工艺为：在液料比15 mL/g、盐酸浓度0.2 mol/L、提取温度75 ℃、提取时间1.6 h。本工艺操作简便、提取效率高，有利于推动博落回资源节约和生物碱成分分离。