多花木蓝（Indigofera amblyantha）为豆科木蓝属饲用灌木[1]，丰产性能好、营养价值高，具有分枝能力强、适应性强、利用年限长等优点[2]。多花木蓝嫩枝期适口性好[3]。但是，多花木蓝在青贮过程中由于自身蛋白水解酶和微生物的作用，约60%的蛋白物质被转化为不同形式的非蛋白氮（NPN）[4]。NPN不能被家畜有效利用，且蛋白质降解产生胺类会减少反刍动物的干物质采食量[5]。青贮过程中蛋白质的大幅度分解是影响青贮牧草营养价值和利用价值的重要因素[6]。无籽刺梨是蔷薇科蔷薇属植物。近年来，无籽刺梨在贵州省的种植比例增加，其深加工过程中会产生40%~50%的果渣[7]。贵州省每年可产生1.5万t各类刺梨果渣[8]。大多数刺梨果渣被直接丢弃，未得到高效利用[9]。研究表明，刺梨渣中含有丰富的酚类、黄酮类、有机酸和超氧化物歧化酶等多种活性成分[10-12]。其中，有机酸主要为苹果酸、乳酸、柠檬酸和草酸等[13]，而酚类中单宁的含量约占0.6%~2.2%[6]。单宁和有机酸能够抑制青贮过程中蛋白质降解和杂菌增殖[14-16]。刺梨渣水分含量高且含大量的单宁和粗纤维，直接作为饲粮会受到一定制约。将刺梨渣开发为青贮饲料的添加剂或辅料较为理想。本研究以刺梨渣为添加剂发酵多花木蓝，利用其单宁、有机酸等化学成分抑制蛋白质降解，对促进豆科灌木资源利用和缓解我国畜牧业优质蛋白质饲料不足具有重要意义。1材料与方法1.1试验材料多花木蓝于务川仡佬族苗族自治县桃符构树产业孵化园内种植，植株高度约40 cm刈割，留茬高度5 cm，粉碎。刺梨渣原料采自贵州省六枝特区的金刺梨加工企业，自然干燥，保存。多花木蓝和无籽刺梨渣原料的营养成分见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.025.T001表1多花木蓝和无籽刺梨渣原料的营养成分（干物质基础）项目干物质粗蛋白质中性洗涤纤维酸性洗涤纤维可溶性碳水化合物多花木蓝32.0416.1268.9847.922.22无籽刺梨渣25.784..4466.9344.723.37%1.2试验设计试验设置1个对照组和3个处理组，对照组为100%多花木蓝（CK），处理组按添加刺梨渣的比例不同分为CLA组（5%刺梨渣+95%多花木蓝）、CLB组（10%刺梨渣+90%多花木蓝）和CLC组（20%刺梨渣+80%多花木蓝），每组12个重复。刺梨渣与多花木蓝混合均匀后取样100 g于100 mL的PVC管中，充分压实，密封发酵，发酵第5、15、30、40 d分别取样，每次取样3个重复，-80 ℃冰箱保存。1.3测定指标及方法1.3.1营养成分发酵第40 d，称取100 mL青贮样品，参照《饲料分析及饲料质量检测技术》，采用烘干恒重法测定DM含量；采用VAN SOEST法测定ADF和NDF含量，采用蒽酮-硫酸比色法测定WSC含量[17]。1.3.2发酵品质发酵第40 d取样，称取青贮样品20 g，加入180 mL蒸馏水，涡旋振荡混匀，使用纱布过滤获取浸提液，使用pH测定仪测定pH值。采用高效液相色谱法测定乳酸和挥发性脂肪酸（VFA）含量[18-21]。1.3.3氮组分发酵第5、15、30、40 d取样，每次取样3个重复，测定其氮组分指标。采用苯酚-次氯酸钠法测定氨态氮（NH3-N）含量；使用全自动定氮仪测定总氮（TN）含量；采用凯氏定氮法测定非蛋白质氮（NPN）、游离氨基酸（FAA-N）含量；采用茚三酮—硫酸肼比色法测定肽氮（Peptide-N）含量。Peptide-N=NPN-(FAA-N+NH3-N)（1）1.3.4酶活性发酵第5、15、30、40 d取样，每次取样3个重复，采用分光光度法测定羧基肽酶、氨基肽酶以及酸性蛋白降解酶的活性。1.4数据统计与分析数据采用SPSS 22.0软件（One-way ANOVA）进行方差分析，Duncan's法进行多重比较，结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1刺梨渣对多花木蓝青贮营养成分量的影响（见表2）由表2可知，与CK组相比，CLA组、CLB组和CLC组DM和WSC含量均显著提高（P0.05）。其中，CLC组DM含量最高，CLB组WSC含量最高。与CK组相比，CLC组的CP含量显著低于其他各组（P0.05）。CLC组的NDF含量显著低于CK组（P0.05），CLA组的ADF含量显著低于CK组和CLB组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.025.T002表2刺梨渣对多花木蓝青贮营养成分的影响（干物质基础）组别DMCPNDFADFWSCCK组35.83±0.69B14.74±1.35A62.90±1.67A42.63±1.70A2.06±0.26BCLA组41.23±0.22A13.09±0.88A55.72±8.37AB34.67±3.52B3.61±0.78ACLB组41.36±1.55A13.13±0.95A58.02±4.47AB43.30±6.01A4.66±0.43ACLC组44.15±1.29A11.32±0.69B53.14±1.63B38.87±0.76AB4.45±1.11A注：同列数据肩标大写字母不同表示差异显著（P0.05），大写字母相同或无字母表示差异不显著（P0.05），ND表示未检出；表3与此同。%2.2刺梨渣对多花木蓝青贮发酵品质的影响（见表3）由表3可知，与CK组相比，随着刺梨渣添加比例的升高，发酵第40 d的pH值呈先升高后降低的趋势，CLA组的pH值最高，CLC组最低，且CLA组的pH值显著高于其他各组（P0.05），CK组和CLB组显著高于CLC组（P0.05）。CLC组的乳酸含量显著高于CK组和CLA组（P0.05）。仅在CK组和CLA组检测到丙酸，CLA组、CLB组和CLC组中均未检出丁酸。与CK组相比，发酵第40 d时，CLA组和CLC组氨态氮/总氮显著降低（P0.05），且CLC组氨态氮/总氮最低。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.025.T003表3刺梨渣对多花木蓝青贮发酵品质的影响（干物质基础）组别pH值乳酸/(g/kg)乙酸/(g/kg)丙酸/(g/kg)丁酸/(g/kg)氨态氮/总氮CK组4.23±0.03B34.16±1.46B24.87±1.400.95±0.04A0.13±0.020.068 50±0.013 45ACLA组4.57±0.07A32.03±1.91B24.91±1.070.24±0.24BND0.052 50±0.296 50BCLB组4.26±0.26B37.84±1.71AB23.56±1.55NDND0.065 70±0.012 19ACLC组3.88±0.04C40.25±1.53A21.71±1.62NDND0.023 90±0.016 39B2.3刺梨渣对多花木蓝青贮氮组分的影响（见表4）由表4可知，各处理组NPN含量均以发酵第40 d时含量最高，CK组和CLC组第40 d的NPN含量显著高于第5、15、30 d（P0.05）；CK组发酵第30 d的NH3-N含量显著高于第5、15、40 d，CLB组第40 d的NH3-N含量显著高于第5、15 d（P0.05）；CK组和CLB组发酵第30 d的FAA-N含量显著高于CLA组（P0.05）；CK组和CLC组发酵第40 d Peptide-N含量显著高于其他发酵阶段（P0.05），CLA组第40 d的Peptide-N含量显著高于第15、30 d，CLB组第40 d显著高于第30 d（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.025.T004表4刺梨渣对多花木蓝青贮氮组分的影响项目5 d15 d30 d40 dNPNCK组30.93±1.71Cb66.94±35.39b45.64±9.93b221.90±45.41AaCLA组119.10±32.94Aab77.21±16.43b86.23±32.17b169.87±47.99ABaCLB组80.20±24.68ABab75.29±13.37ab62.43±18.51b101.63±18.07BaCLC组62.68±7.27BCb60.05±14.91b87.48±22.80b139.33±18.72BaNH3-NCK组8.17±2.45c12.22±2.42Ab19.48±0.33Aa14.91±2.40AbCLA组7.09±2.155.13±2.70B8.25±3.72B8.06±2.26BCLB组3.19±1.29b3.39±0.06Bb4.89±2.24Bab6.53±0.26BCaCLC组5.40±16.703.20±1.60B6.65±7.45B3.29±2.09CFAA-NCK组7.50±0.43Ab8.01±1.13Aab9.22±0.45Aa7.52±0.65bCLA组6.47±1.13AB6.78±0.64AB7.19±0.64B6.17±0.37CLB组5.28±0.11BCb5.91±0.62BCab6.88±0.77Ba5.74±1.15abCLC组4.63±0.70C4.66±0.66C5.42±0.96C6.25±1.31Peptide-NCK15.26±3.61Cb46.72±34.23b16.94±9.85Bb199.48±44.76AaCLA105.54±35.28Aab65.29±19.31b70.78±29.76Ab155.64±49.47ABaCLB71.72±24.51ABab65.99±12.91ab50.66±18.17ABb89.36±17.27BaCLC42.65±14.91BCb52.19±13.93b75.42±25.04Ab129.78±19.51ABa注：同列数据肩标大写字母不同表示差异显著（P0.05），大写字母相同或无字母表示差异不显著（P0.05）；同行数据小写字母不同表示差异显著（P0.05），小写字母相同或无字母表示差异不显著（P0.05）；表5与此同。g/kg TN发酵第5 d，CLA组的NPN含量显著高于CK组和CLC组（P0.05），CLB组NPN含量显著高于CK组（P0.05）；发酵第40 d，CK组NPN含量显著高于CLB组和CLC组（P0.05）。与CK组相比，NH3-N含量在发酵第15、30、40 d时均显著高于CK组（P0.05）。CK组的FAA-N含量在发酵第5、15 d显著高于CLB和CLC组（P0.05）。发酵第5 d，CLA组的Peptide-N含量显著高于CK组和CLC组（P0.05）；发酵30 d，CLA和CLC组的Peptide-N含量均显著高于CK组（P0.05），而CK组的Peptide-N含量在发酵第40 d显著高于CLB组（P0.05）。2.4刺梨渣对多花木蓝青贮酶活性的影响（见表5）由表5可知，CK组在发酵第15、30 d的羧基肽酶活性显著高于第5 d（P0.05），CLA组发酵第40 d的羧基肽酶活性显著高于第15 d（P0.05）。CLA组发酵第5 d的氨基肽酶活性显著高于第30 d（P0.05），CLB组发酵第15 d的氨基肽酶活性显著高于第5、40 d（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.025.T005表5刺梨渣对多花木蓝青贮酶活性的影响项目5 d15 d30 d40 d酸性蛋白酶CK组0.94±0.120.86±0.220.95±0.09AB0.87±0.16CLA组0.95±0.080.90±0.080.86±0.12AB0.87±0.06CLB组0.95±0.160.88±0.090.84±0.04B0.81±0.04CLC组1.00±0.041.01±0.161.02±0.07A0.88±0.11续表5　刺梨渣对多花木蓝青贮酶活性的影响 单位：U/g鲜重U/g鲜重10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.025.T006项目5 d15 d30 d40 d羧基肽酶CK组1.05±0.48Bb1.72±0.23Aa1.87±0.13a1.44±0.23abCLA组1.56±0.15Aab1.12±0.44Bb1.30±0.14ab1.59±0.09aCLB组1.94±0.15A1.38±0.39AB1.72±0.181.74±0.34CLC组1.73±0.26A1.75±0.18A1.52±0.631.66±0.12氨基肽酶CK组4.13±0.47B4.09±0.19B4.26±0.104.22±0.32CLA组4.87±0.27Aa4.08±0.45Bab3.99±0.45b4.19±0.57abCLB组4.03±0.08Bb4.74±0.32Aa4.40±0.13ab4.10±0.46bCLC组4.98±0.20A4.70±0.25A4.32±0.323.97±1.19发酵第5 d，CLA组、CLB组和CLC组的羧基肽酶活性显著高于CK组（P0.05）；发酵第15 d，CK组和CLC组的羧基肽酶显著高于CLA组（P0.05）。发酵第30 d，CLC组的酸性蛋白酶活性显著高于CLB组（P0.05）。发酵第5 d时，CLA和CLC组的氨基肽酶活性显著高于CK组和CLB组（P0.05）；发酵第15 d，CLB组和CLC组的氨基肽酶活性显著高于CK组和CLA组（P0.05）。3讨论3.1刺梨渣对多花木蓝青贮营养成分的影响DM是青贮发酵启动的关键，WSC是青贮的发酵底物。在青贮过程中，植物细胞的呼吸作用与微生物发酵造成青贮原料中DM的损失[22]。本研究中，添加刺梨渣提高了多花木蓝青贮中的DM和WSC含量，DM含量以20%刺梨渣添加组最高，CLB组的WSC含量最高，说明添加刺梨渣为多花木蓝青贮提供了额外的发酵底物，与艾琪等[23]和郭睿等[24]通过添加残次苹果发酵物增加稻草青贮的DM和WSC含量的结果一致。本研究中，添加20%刺梨渣时的粗蛋白质含量显著降低，与原料中刺梨渣的粗蛋白质含量低于多花木蓝有关。原料中纤维含量越高，青贮发酵越难，青贮饲料适口性越差[16]。本研究中，刺梨渣有降低多花木蓝青贮饲料NDF和ADF含量的趋势，说明添加刺梨渣有助于多花木蓝的进一步利用。3.2刺梨渣添加量对多花木蓝青贮发酵品质的影响pH值在发酵初期快速下降能够有效抑制有害微生物的增殖，通过抑制蛋白水解酶活性减少蛋白质损失。本研究中，多花木蓝青贮发酵40 d时的pH值随刺梨渣添加比例增加总体呈下降趋势，且以添加20%刺梨渣时最低，与刺梨果实中含有苹果酸、乳酸、柠檬酸等多种有机酸有关[13]。添加刺梨渣为青贮发酵提供更多的发酵底物，能够促进乳酸快速产生，从而使pH值降低。低pH值环境抑制杂菌的增殖，能够抑制植物蛋白酶的活性，减少蛋白质降解[25]。本研究中，随着多花木蓝青贮中刺梨渣添加比例的提高，发酵40 d的乳酸含量逐渐增加，乙酸含量有下降趋势。除CLA组发酵40 d检测到少量丙酸外，CLB组和CLC组均未检测到丙酸和丁酸，表明添加刺梨渣能够改善多花木蓝青贮发酵品质，可能是刺梨渣中的单宁和有机酸共同作用的结果。NH3-N/TN的数值反映青贮过程的蛋白质降解程度，数值越低，青贮品质越好[26]。本研究中，添加刺梨渣使多花木蓝发酵40 d时NH3-N/TN的数值逐渐降低，且以添加20%刺梨渣发酵40 d时的数值最低，进一步说明刺梨渣能够抑制多花木蓝青贮蛋白质降解。3.3刺梨渣对多花木蓝青贮氮组分的影响青贮过程中牧草蛋白质的降解导致NPN含量升高。NPN不仅造成真蛋白损失，而且组成NPN的NH3-N、FAA-N和Peptide-N影响家畜对饲料中蛋白质的利用。本研究中，随着发酵时间延长，对照组的NPN含量由发酵30.93 g/kg增加至221.9 g/kg，表明多花木蓝在青贮过程中大量蛋白质降解为NPN，与在苜蓿、构树等豆科牧草青贮上的研究结果相似[27-31]。发酵40 d时，10%和20%刺梨渣添加组的NPN含量均显著低于对照组，说明添加一定比例的刺梨渣能够有效减少多花木蓝青贮的蛋白质降解。董文成等[31]研究表明，苜蓿青贮中分别添加3个品种葡萄渣能够显著降低发酵60 d时的NPN和NH3-N含量，与本研究结果一致，可能是由于刺梨渣中的单宁在酸性条件下能与蛋白质结合形成蛋白质-酚化合物，阻止蛋白质被降解[32]。青贮中大量NH3-N的生成会影响青贮品质。本研究中，添加刺梨渣有效抑制了NH3-N的生成，且NH3-N生成量在发酵末期与刺梨渣添加比例呈负相关。原因可能是单宁能够抑制游离氨基酸脱氨基，减少NH3-N的生成[28]。青贮中NH3-N主要来源于微生物和植物蛋白酶的降解作用[33]。也有研究称，青贮中的NH3-N主要是微生物作用的结果，而非植物蛋白酶活动[34]。FAA-N青贮发酵早期植物蛋白酶水解蛋白质的产物，在青贮发酵后期，微生物蛋白酶逐渐代替植物蛋白酶的作用，从而产生更多的FAA-N[35]。本研究中，在青贮前30 d，各组FAA-N含量随发酵进程逐渐增加，与对照组相比，添加刺梨渣有效降低了FAA-N的产生，可能是刺梨渣组的pH值比对照组的pH值更低，抑制了植物蛋白酶活性，与Li等[36]低pH值环境使蛋白质水解产生的FAA-N减少的结果一致。与FAA-N相同，Peptide-N的产生也是发酵前期在植物蛋白酶作用下由蛋白质水解，但随后因微生物增殖对肽的需要而下降，发酵后期因微生物蛋白酶的降解作用而升高。本试验中，青贮中以Peptide-N形式存在的氮含量最多，说明在多花木蓝青贮发酵过程蛋白质降解主要受植物蛋白酶作用。与CK组相比，CLA组、CLB组和CLC组在发酵前30 d的Peptide-N含量较高，且第5、30 d时差异显著；发酵40 d时Peptide-N含量低于CK组，可能是植物蛋白酶活性低，即使在良好的青贮条件下也不能引起更大程度的蛋白质水解。3.4刺梨渣对多花木蓝青贮酶活性的影响植物蛋白酶对细胞内的细胞蛋白质循环和降解具有影响。牧草青贮时，蛋白质水解酶由于机械损伤或厌氧环境造成细胞破裂被释放，将真蛋白降解为短链肽和游离氨基酸[29]。青贮过程中的蛋白质降解是植物蛋白酶和微生物酶共同作用引起的[37]。植物蛋白酶的活性受温度、pH值和添加剂等多种因素影响，而单宁对植物酶和微生物酶均具有广泛的抑制作用[38]。研究表明，青贮过程中，酸性蛋白水解酶和羧基肽酶在整个青贮过程中均对植物蛋白的降解起重要作用，而氨基肽酶只在构树青贮的前7 d对植物蛋白的降解起作用[27]。本研究中，酸性蛋白酶和羧基肽酶的活性仅在较小范围内波动，未发现添加刺梨渣对多花木蓝青贮植物蛋白酶活性的作用规律，与董文成等[31]的研究结果不同，可能是由试验材料、青贮温度或刺梨渣中的单宁结构差异导致的。刺梨渣可能并非主要通过抑制植物蛋白酶活性减少青贮蛋白质的降解，但本研究中未跟踪测定青贮早期的植物蛋白酶活性动态变化，相关推测有待进一步研究。4结论添加刺梨渣有助于提高多花木蓝青贮营养成分和发酵品质，能够有效减少多花木蓝青贮的蛋白质降解，但未对植物蛋白酶活性造成显著影响。综合分析认为，多花木蓝青贮中添加20%刺梨渣的效果最佳。