花鳅（Cobitis taenis）为鲤形目，鳅科，花鳅属种类，分布于吉林省长白山地区的活水环境中[1]，食物多为溪流、河水中的水生植物、微生物或小型无脊椎动物。花鳅因其香鲜味美、肉质紧致细腻并且富含二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）而备受本地人的喜爱。花鳅还是一味中药材，有很高的药用价值。因此，花鳅具有较高的经济价值和开发潜力。蜜环菌（Armillaria mellea）具有增强免疫、提高抗氧化能力、降低致病菌的侵入等多种功能，广泛应用于药品、保健品、功能食品等领域。本研究团队前期工作发现，蜜环菌发酵饲料对洛氏鱥生长的性能、免疫、抗氧化能力以及肠道菌群具有积极影响[2]。因此，本试验进一步研究蜜环菌发酵饲料对花鳅生长性能、消化、免疫以及抗氧化能力的影响，为其在水产养殖中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验饲料基础饲料组成及营养水平见表1。基础饲料经粉碎，灭菌，在超净台上接入蜜环菌菌液，每千克基础饲料中分别添加0、6、12、18 mL蜜环菌菌液，对应加入100、94、88、82 mL双蒸水，（20±2）℃密封，无光发酵48 h，制成直径1 mm的沉水颗粒料，阴凉处风干后放入（4±2）℃封存。蜜环菌菌液制备参考刘景圣等[3]液体培养方法，以马铃薯、葡萄糖、蚕蛹粉、维生素B1、硫酸镁和磷酸二氢钾作为底物，观察菌丝体生长旺盛、发酵液呈棕褐色、有荧光且pH值约为5时，终止发酵，冰箱冷藏保存。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.013.T001表1基础饲料组成及营养水平原料组成含量营养水平合计100.00进口鱼粉3.00粗蛋白30.75大豆粕（48%）34.66粗脂肪4.00胚芽粕13.44粗灰分8.10DDGS15.00粗纤维6.00玉米19.28钙0.79棉籽粕（47%）10.00总磷1.05油脂2.00氯化钠1.48磷酸氢钙2.00赖氨酸1.7098%赖氨酸0.36蛋氨酸0.34蛋氨酸0.13苏氨酸1.17维生素预混料0.13注：1.维生素预混料购自常州渔经生物技术有限公司。2.营养成分均为实测值。%1.2试验动物将360尾初始体重（0.92±0.06）g、外观正常、健康活泼的花鳅，随机分成4组，每组3个重复，分别置于白色水族箱（长宽高分别为1.5、1.0、0.8 m，聚乙烯塑料材质）。1.3饲养管理试验饲养期间，每周更换1次饲养用水，饲养用水经曝气24 h，按照水温（13±2）℃，酸碱度值7.0~7.5，溶解氧含量高于5.0 mg/L，氨氮含量低于0.01 mg/L，硫化物含量低于0.05 mg/L的水质条件要求进行处理后使用。每日分别于6：00和18：00投喂饲料2次。每次投喂时准确称取足量的饲料，投喂30 min，使用虹吸管吸出残饵，置于恒温烘干箱中，（60±2）℃烘干、称重，二者之差即为每日摄食量。试验期13 w，停止饲喂24 h收集样品。1.4测定指标及方法1.4.1饲料营养成分粗蛋白测定：通过SH230消解仪（济南海能仪器股份有限公司）对发酵后的饲料进行处理，参照GB/T 6432—2018方法，利用K9840全自动凯氏定氮仪（济南海能仪器股份有限公司）进行测定粗蛋白含量。粗脂肪测定：参照GB/T 6433—2006方法，通过SOX406索氏提取仪（济南海能仪器股份有限公司）以石油醚作为提取剂将发酵后饲料进行测定粗脂肪含量。灰分测定：参照GB/T 6438—2007方法，通过SX2-12-12Z马弗炉（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）将发酵后饲料550 ℃灼烧后测定灰分含量。1.4.2生长性能试验开始分别记录每一饲养水族箱中鱼体总重（W0，g）、鱼尾数（N0，条）、试验末鱼体总重（Wt，g）、试验末鱼尾数（Nt，条）、试验末鱼体长（L，cm），记录饲养时间（t，d）、摄食量（F，g）。生长性能指标分析参考钟小群等[4]方法。成活率(SR, %)=Nt/N0×100%(1)增重率(WGR, %)=(Wt-W0)/W0×100%(2)特定生长率(SGR, %/d)=(lnWt-lnW0)/t×100%(3)饲料系数(FCE)=F/(Wt-W0)(4)肥满度(CF, g/cm3)=Wt/L3×100(5)1.4.3消化、免疫和抗氧化指标每箱随机取5尾花鳅混样检测。活鱼使用MS-222麻醉，解剖取出肝胰脏，采用吸水纸去除表面水分，称取组织重量。冰浴条件下，按质量（g）与体积（mL）9∶1加入生理盐水，经玻璃研磨器处理的肝胰脏组织装入离心管，（4±1）℃ 2 500 r/min离心10 min，取上清液检测相关指标。采用南京建成生物工程研究所试剂盒，按照说明书进行测定淀粉酶（AMS）、脂肪酶（LPS）、胰蛋白酶（TPS）、溶菌酶（LZM）、超氧化物歧化酶（SOD）以及总抗氧化能力（T-AOC）等指标。1.5数据统计与分析试验数据采用Excel 2020软件处理，采用SPSS 25.0进行单因素方差分析（One-way ANOVA），采用Dancan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1蜜环菌发酵饲料营养成分（见表2）由表2可知，蜜环菌发酵后的基础饲料，随着菌液量增加，发酵饲料的粗蛋白含量逐渐升高，而粗脂肪含量则持续下降，但各组间的粗蛋白、粗脂肪和灰分含量均无显著差异（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.013.T002表2蜜环菌发酵饲料营养成分组别粗蛋白粗脂肪灰分对照组31.514.449.62试验1组32.144.419.61试验2组32.364.399.61试验3组32.674.389.62%2.2蜜环菌发酵饲料对花鳅生长性能的影响（见表3）由表3所示，饲养13 w后4组花鳅成活率均为100%。随着蜜环菌菌液添加量的增加，花鳅的增重率、特定生长率和肥满度均呈现出先升高后降低趋势，饲料系数呈现出先降低后升高趋势，各组间数据均无显著差异（P0.05）。试验2组花鳅的生长性能表现最优。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.013.T003表3蜜环菌发酵饲料对花鳅生长性能的影响组别初重/g末重/gSR/%WGR/%SGR/(%/d)FCECF/(g/cm3)对照组0.93±0.074.80±0.26100.00±0.00419.29±20.531.81±0.041.33±0.080.95±0.01试验1组0.92±0.044.86±0.26100.00±0.00441.83±9.811.86±0.021.27±0.060.96±0.05试验2组0.93±0.074.96±0.35100.00±0.00451.76±16.761.88±0.031.23±0.080.96±0.02试验3组0.92±0.064.85±0.25100.00±0.00432.99±11.281.84±0.021.28±0.060.96±0.052.3蜜环菌发酵饲料对花鳅消化、免疫和抗氧化能力的影响（见表4）由表4可知，试验2组和试验3组花鳅肝胰脏AMS活性显著高于对照组（P0.05）；花鳅肝胰脏LPS活性随蜜环菌菌液添加量同样呈正相关，但4组间无显著差异（P0.05）；花鳅肝胰脏TPS活性随着蜜环菌菌液添加量的增加而呈现上升后下降的趋势，试验2组花鳅肝胰脏TPS活性显著高于对照组（P0.05）；试验2组花鳅肝胰脏LZM活性显著高于其他3组（P0.05）；试验2组花鳅肝胰脏SOD活性显著高于其他3组（P0.05）；试验2组花鳅肝胰脏T-AOC显著高于其他3组（P0.05），试验1组和试验3组花鳅肝胰脏T-AOC差异不显著（P0.05）。因此，试验2组花鳅在消化酶、免疫和抗氧化指标方面表现最优。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.013.T004表4蜜环菌发酵饲料对花鳅消化、免疫和抗氧化能力的影响组别AMS/(U/mg)LPS/(U/g)TPS/(U/mg)LZM/(U/mg)SOD/(U/mg)T-AOC/(mmol/g)对照组1.33±0.03c23.44±1.2479.35±2.37b3.07±0.36d30.76±2.43c1.85±0.13c试验1组1.44±0.05c24.54±1.1282.15±2.51ab4.49±0.16c66.10±3.57b2.08±0.17b试验2组1.77±0.08b24.79±1.1185.49±2.59a8.75±0.36b87.37±4.67a3.42±0.21a试验3组2.07±0.11a25.01±1.0084.80±2.38ab5.69±0.44a75.22±4.88b2.52±0.20b注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）。3讨论3.1蜜环菌发酵对饲料营养成分的影响当在基础饲料中添加微生物后，增加了粗蛋白质、小肽和总氨基酸等营养成分的含量，减少了粗脂肪含量，从而提高基础饲料的营养价值。对构树叶发酵饲料营养成分研究发现，在添加作物秸秆5 d和9 d时，发酵后饲料中粗蛋白质含量分别增加16.3%和23.9%[5]。对饲料固态发酵营养成分研究发现，发酵后饲料的粗蛋白质、总磷、小肽和总氨基酸含量均显著升高，粗脂肪含量显著下降[6]。本试验在基础饲料中添加蜜环菌进行发酵，结果与上述结果相似。原因可能是蜜环菌利用基础饲料合成新的蛋白质增加了小肽的含量[7]，降解饲料中的抗营养因子，进而提高饲料的营养价值[8]。3.2蜜环菌发酵饲料对花鳅生长性能的影响生物发酵饲料香味浓郁，具有极佳的诱食效果；适口性好，可增加采食积极性和频率；易被消化吸收，有利于促进动物生长发育，因此在水产养殖中被广泛应用[9]。适量的微生物发酵饲料可促进罗非鱼生长，提高成活率，降低饲料系数[10]。豆粕经微生物发酵后，可明显提高鳗鱼增重率，降低饲料系数[11]。发酵饲料对黄河鲤的生长、增重率、饵料系数、蛋白质效率等均具有显著的积极影响[12]；发酵豆粕代替部分鱼粉能够显著提高中华绒蟹幼蟹的生长性能[13]。本研究中，蜜环菌发酵饲料能够提高花鳅的增重率、特定生长率和肥满度，降低饲料系数。但菌液的用量决定发酵饲料的饲喂效果，若使用过量，饲料效果反而下降[14]。本试验中，试验2组花鳅的增重率、特定生长率、饲料系数和肥满度最佳，优于试验1组和试验3组，说明过多使用蜜环菌发酵对提高花鳅生长性能无积极作用；但各组间花鳅在各项生长性能指标方面未出现显著差异，可能是因为饲养水温约为13 ℃，水温较低导致生长缓慢，且饲养时间较短，仅有13 w，因此各组花鳅的生长性能未产生显著差异。3.3蜜环菌发酵饲料对花鳅消化酶、免疫和抗氧化能力的影响研究表明，饲料中脂肪含量与淀粉酶活性呈负相关，即饲料中若脂肪含量较低，则会提高鱼类消化液分泌量和淀粉酶活性[15]；脂肪酶与鱼类体长、体重相关性不强，甚至负相关；胰蛋白酶与鱼类体长、体重呈显著的正相关[16]。本研究中，蜜环菌菌液用量增多，淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶的活性变化也符合上述规律，说明蜜环菌在发酵时会产生包括淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶等在内的多种消化酶，会保持较长时间的高活性，可以作为外源性酶提高花鳅消化吸收能力[17]。肝胰脏作为动物的代谢活动中心，免疫和抗氧化能力直接影响机体的健康状况。花鳅生活在相对封闭的饲养水族箱中，极易受病原体的侵袭。因此，在抵抗病害方面，非特异性免疫比特异性免疫针对某些既定病原体更为重要[18]。溶菌酶作为非特异性免疫指标之一，抗菌、抑菌[19]、破坏病原体细胞壁、启动免疫保护机制时发挥重要作用[20]。超氧化物歧化酶可以清除活性氧自由基，增强免疫能力[21]；总抗氧化能力反映各种抗氧化酶的总活性，消除活性氧自由基，避免引发脂质过氧化，分解过氧化物，阻断过氧化链，去除具催化作用金属离子等[22]，对提升免疫能力具有重要作用。本试验结果显示，饲喂蜜环菌发酵饲料提高了花鳅肝胰脏溶菌酶、超氧化物歧化酶活性以及总抗氧化能力。一方面，可能是蜜环菌发酵的饲料中小分子肽类和游离氨基酸含量增多，花鳅食用后机体非特异性免疫能力增强；另一方面，可能是蜜环菌大量繁殖，被利用后增强了机体的体液和细胞免疫功能。另外，菌液用量的控制决定了动物取食后的免疫和抗氧化功能，使用过量，并不会持续提高动物的免疫和抗氧化功能[23-24]。本试验中，试验2组花鳅的溶菌酶、超氧化物歧化酶的活性以及总抗氧化能力最优，优于试验1组和试验3组，说明少量或过量使用蜜环菌菌液无法达到最佳效果。4结论本试验中，蜜环菌发酵提高了基础饲料的粗蛋白含量，降低了粗脂肪含量，对花鳅的生长性能和消化、免疫以及抗氧化能力均具有积极影响，但应注意蜜环菌使用剂量。