Optimization of the extraction process and antioxidant activities of a potential active ingredient against mastitis from Clerodendrum cyrtophyllum Turcz.奶牛乳房炎是由细菌、病毒、机械损伤等因素引起的疾病，是造成奶牛养殖业巨大经济损失的常见病之一[1]。临床治疗方面，主要以针对金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、链球菌等病原菌的抗生素疗法为主[2]。但长期大量使用抗生素容易引起牛奶中抗生素残留，使奶牛产生耐药性[3-4]，严重危害公共卫生安全[5-6]。植物中含有大量的活性物质，具有抗氧化、抗菌等功能[7]。植物中提取的活性物质作为饲料添加剂使用，具有安全性高、毒副作用小[8]等特点。因此，从植物中寻求防治奶牛乳房炎的新型饲料添加剂，已成为当今畜牧养殖业研究的热点[9]。大青木（Clerodendrum cyrtophyllum Turcz.）为马鞭草科大青属植物[10]，性凉、味苦，具有清热凉血、解毒利湿等功效。苗医常用大青木水煎液内服，治疗疱疹病毒感染和流行性感冒等[11-12]。本课题组前期研究在大青木中分离得到潜在抗奶牛乳房炎活性组分——类叶升麻苷与木樨草苷。其中，类叶升麻苷表现出较强的抗氧化活性[13]，可对抗乳腺炎症反应产生的过氧化物，进而缓解或阻止其炎症反应，达到修复乳腺细胞的作用[14]；木樨草苷表现出较强的抗菌活性[15-16]，可对病原菌起直接杀灭作用，两者发生协同作用，进而达到抗奶牛乳房炎的效果。通过提取工艺优化富集，类叶升麻苷与木樨草苷可能作为饲料添加剂预防和治疗奶牛乳房炎。因此，本研究拟对大青木中类叶升麻苷与木樨草苷的提取工艺进行优化，旨在为后续大青木的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料大青木（Clerodendron cyrtophyllum Turcz.）采自贵州省贵定县云雾镇，经贵州中医药大学孙庆文教授鉴定为马鞭草科大青属植物。类叶升麻苷标准品购自成都德思特生物技术有限公司，批号DSTDL006101；木樨草苷标准品购自成都普菲德生物技术有限公司，批号20060301；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,2'-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（ABTS）、抗坏血酸、水杨酸购自合肥巴斯夫生物科技有限公司；甲醇、无水乙醇均为分析纯，购自成都市科隆化学品有限公司；乙腈、甲醇均为色谱纯，购自上海星可高纯溶剂有限公司；磷酸购自重庆川东化工（集团）有限公司；过硫酸钾购自天津市百世化工有限公司；硫酸亚铁购自天津市永大化学试剂有限公司。1.2试验仪器UItiMate 3000型高效液相色谱仪购自赛默飞世尔科技公司；DK-98-Ⅱ型电热恒温水浴锅购自天津市泰斯特仪器有限公司；UV-1900i紫外分光光度仪购自岛津公司；Rotavapor R-3型数显旋转蒸发仪购自瑞士步琦有限公司；SK3300B型超声波清洗器购自上海科导超声仪器有限公司；FW177型手提式高速粉碎机购自天津泰斯特仪器有限公司；FR124CN型分析天平购自奥豪斯仪器有限公司。1.3试验方法1.3.1HPLC法测定类叶升麻苷和木樨草苷含量1.3.1.1色谱条件Syncronis C18色谱柱：（250 mm×4.6 mm，0.5 μm）；柱温：30 ℃；流动相：乙腈-0.1%磷酸水溶液为20∶80；流速：1.0 mL/min；检测波长：332 nm；进样体积：5 μL。1.3.1.2供试品溶液的制备精密称取过80目筛的大青木粉末10 g，置于500 mL圆底烧瓶中，液料比15 mL/g，加入70%乙醇，80 ℃水浴加热回流1次，提取1 h，趁热过滤，合并滤液，浓缩得到大青木浸膏。精密称取大青木浸膏20 mg超声溶于50%甲醇溶液中，配制成5.0 g/L的溶液，使用有机微孔滤膜（0.45 μm）过滤，得到供试品溶液。1.3.1.3混合对照品溶液的制备精密称取类叶升麻苷、木樨草苷标准品各25.0 mg，置于50 mL容量瓶中，加50%甲醇溶液定容至刻度，混匀得到对照品溶液。1.3.1.4线性关系分别精密吸取2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL混合对照品溶液，置于10 mL容量瓶中，定容至刻度，即得0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L的混合标准品溶液，按照1.3.1.1色谱条件测定峰面积。以两种成分的浓度（x）为横坐标，对应的峰面积（y）为纵坐标，绘制相对应的标准曲线。1.3.2提取工艺试验1.3.2.1单因素试验（1）粒度目数对得率的影响：分别精密称取20、40、60、80、100目大青木粉末10 g，按液料比15 mL/g，加入70%乙醇溶液，80 ℃加热回流提取1次，提取1 h，考察不同粒度目数对类叶升麻苷和木樨草苷得率的影响。（2）乙醇浓度对得率的影响：精密称取4份80目大青木粉末10 g，按液料比15 mL/g，分别加入30%、50%、70%、90%乙醇溶液，80 ℃加热回流提取1次，提取1 h，考察不同乙醇浓度对类叶升麻苷和木樨草苷得率的影响。（3）液料比对得率的影响：精密称取4份80目大青木粉末10 g，分别按液料比15、20、25、30 mL/g，加入70%乙醇溶液，80 ℃加热回流提取1次，提取1 h，考察不同液料比对类叶升麻苷和木樨草苷得率的影响。（4）提取次数对得率的影响：精密称取3份80目大青木粉末10 g，按液料比15 mL/g，加入70%乙醇溶液，分别在80 ℃加热回流1、2、3次，每次提取1 h，考察不同提取次数对类叶升麻苷和木樨草苷得率的影响。（5）提取时间对得率的影响：精密称取5份80目大青木粉末10 g，按液料比15 mL/g，加入70%乙醇溶液，80 ℃加热回流1次，分别提取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，考察不同提取时间对类叶升麻苷和木樨草苷得率的影响。（6）提取温度对得率的影响：精密称取4份80目大青木粉末10 g，按液料比15 mL/g，加入70%乙醇溶液，分别在75、80、85、90 ℃加热回流次，提取1 h，考察不同提取温度对类叶升麻苷和木樨草苷得率的影响。1.3.2.2响应面法优化类叶升麻苷和木樨草苷的提取工艺根据单因素试验表明，考虑各方面的试验情况，选取提取温度（A）、液料比（B）、乙醇浓度（C）为考察因素，以类叶升麻苷和木樨草苷得率的“归一值（OD）”为评价指标，根据Box-Behnken的设计原理，利用Design-Expert 10.0.4软件进行3因素3水平的试验设计，对大青木中类叶升麻苷和木樨草苷的提取条件进行优化，响应面优化试验因素和水平设计见表1。综合评价指标是根据Hassan法[17-18]算出的“归一值（OD）”，对类叶升麻苷和木樨草苷得率的整体评价，便于对模型进行综合评价分析。OD计算公式为：di=(Yi-Yimin)/(Yimax-Yimin) (1)OD=(d1d2)1/2 (2)式中：Yi为各因变量每次试验测定数据，Yimax为各因变量各评价指标的最大值，Yimin为各因变量各评价指标的最小值。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.017.T001表1响应面优化试验因素和水平设计项目A提取温度/℃B液料比/(mL/g)C乙醇浓度/%-17015.03008022.56019030.0901.3.3抗氧化活性研究取最优工艺下大青木提取物配制成不同浓度（5、10、30、50、100 mg/L）提取液，测定大青木提取物对DPPH自由基、ABTS自由基、羟自由基的清除能力。1.3.3.1DPPH自由基的清除能力参考文献[19]，分别取2.0 mL 0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液、不同质量浓度样品溶液混合，室温下静置反应30 min，于517 nm波长下测定吸光值A；使用去离子水代替样品溶液后测定空白组吸光值A0；使用去离子水代替DPPH自由基工作液后测定对照组吸光值A1。以抗坏血酸为阳性对照，按照上述方法进行测定。试验重复3次，计算各浓度样品的DPPH自由基清除率。1.3.3.2ABTS自由基的清除能力参考文献[20]，将浓度为7 mmol/L ABTS二铵盐溶液和5 mmol/L过硫酸钾溶液等体积混合，避光反应18 h，使用无水乙醇将其稀释，使其吸光度在734 nm波长下为0.7±0.05，即得ABTS自由基工作液。分别取2.0 mL 7 mmol/L ABTS自由基工作液、不同质量浓度样品溶液混合，避光反应10 min，于734 nm波长下测定吸光值A；使用去离子水代替样品溶液后测定空白组吸光值A0；使用去离子水代替ABTS自由基工作液后测定对照组吸光值A1。以抗坏血酸为阳性对照，按照上述方法进行测定。试验重复3次，计算各浓度样品的ABTS自由基清除率。1.3.3.3羟自由基的清除能力参考文献[21]，分别取9 mmol/L 硫酸亚铁溶液2.0 mL、9 mmol/L 过氧化氢溶液2.0 mL，加入不同质量浓度样品溶液1.0 mL混合摇匀，避光反应10 min，加入9 mmol/L 的水杨酸乙醇溶液1.0 mL，混合均匀，37 ℃水浴中反应30 min，于510 nm波长下测定吸光值A；使用去离子水代替样品溶液混合后测定空白组吸光值A0；使用去离子水代替过氧化氢混合后测定对照组吸光值A1。以抗坏血酸为阳性对照，按照上述方法进行测定。试验重复3次，计算各浓度样品的羟自由基清除率。DPPH自由基、ABTS自由基、羟自由基清除率计算公式为：自由基清除率=[1-(A-A1)/A0]×100%(3)式中：A0为测定波长处空白组的吸光度值；A为测定波长处样品的吸光度值；A1为测定波长处对照组的吸光度值。2结果与分析2.1HPLC法同时测定大青木提取物中类叶升麻苷和木樨草苷的标准曲线（见图1、图2）由图1可知，类叶升麻苷表线性回归方程为y=139.063 2x-0.121 1，R2=0.999 54。由图2可知，木樨草苷线性回归方程为y=194.426 6x-0.408 5，R2=0.999 93。结果表明，类叶升麻苷和木樨草苷在0.1~0.5 g/L的范围内线性关系良好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.017.F001图1类叶升麻苷标准曲线10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.017.F002图2木樨草苷标准曲线2.2单因素试验结果2.2.1粒度目数对类叶升麻苷、木樨草苷得率的影响（见图3）由图3可知，随着粒度目数的增加，大青木提取物中类叶升麻苷和木樨草苷的得率均明显升高；在100目时，达到最大值。因此，选择粒度目数为100目。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.017.F003图3粒度目数对类叶升麻苷、木樨草苷得率的影响2.2.2乙醇浓度对类叶升麻苷、木樨草苷得率的影响（见图4）由图4可知，乙醇浓度在30%~70%时，大青木提取物中类叶升麻苷和木樨草苷的得率随着乙醇浓度的增加而增加；在乙醇浓度为70%时，类叶升麻苷和木樨草苷的得率达到最大值；随后类叶升麻苷和木樨草苷的得率随着乙醇浓度的增大而呈下降趋势；较高浓度的乙醇对类叶升麻苷和木樨草苷的提取具有抑制作用。因此，选择乙醇浓度为70%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.017.F004图4乙醇浓度对类叶升麻苷、木樨草苷得率的影响2.2.3液料比对类叶升麻苷、木樨草苷得率的影响（见图5）由图5可知，随着液料比的增加，类叶升麻苷和木樨草苷的得率逐渐增大；在液料比为25 mL/g时达到最大值；随后类叶升麻苷和木樨草苷的得率呈下降趋势。由于溶剂的量增加，在加热回流过程中，部分溶剂蒸发，消耗一定的热量，导致渗透到植物细胞中的溶剂不能充分汽化，不利于提取。因此，选择液料比为25 mL/g。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.017.F005图5液料比对类叶升麻苷、木樨草苷得率的影响2.2.4提取次数对类叶升麻苷、木樨草苷得率的影响（见图6）由图6可知，随着提取次数的增加，类叶升麻苷和木樨草苷的得率逐渐增加；在提取4次时，达到最大值。但是，提取4次与提取3次相比，类叶升麻苷和木樨草苷的得率增幅较低。因此，综合考虑提取效率及工业成本，选择提取次数为3次。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.017.F006图6提取次数对类叶升麻苷、木樨草苷得率的影响2.2.5提取时间对类叶升麻苷、木樨草苷得率的影响（见图7）由图7可知，随着提取时间的增加，类叶升麻苷和木樨草苷的得率增加；类叶升麻苷的得率在提取1.0 h后，得率趋于平稳；木樨草苷的得率在提取1.5 h后，趋于平稳。因此，综合考虑，选择提取时间为1.5 h。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.017.F007图7提取时间对类叶升麻苷、木樨草苷得率的影响2.2.6提取温度对类叶升麻苷、木樨草苷得率的影响（见图8）由图8可知，随着提取温度的增加，类叶升麻苷和木樨草苷的得率增加；在80 ℃时达到最大值；80 ℃之后，两者得率分别呈下降趋势。温度过低提取不完全，温度过高时会影响类叶升麻苷和木樨草苷的稳定性，导致结构发生变化。因此，选择提取温度为80 ℃。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.017.F008图8提取温度对类叶升麻苷、木樨草苷得率的影响2.3响应面优化试验设计与结果根据Box-Behnken中心组合试验设计原理及单因素试验结果，筛选出对于类叶升麻苷、木樨草苷得率影响较大的3个因素：提取温度（A）、液料比（B）、乙醇浓度（C）为基础，设计3因素3水平响应面分析试验。响应面试验设计方案与结果见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.017.T002表2响应面试验设计方案与结果项目A/℃B/(mL/g)C/%类叶升麻苷得率/(mg/g)木樨草苷得率/(mg/g)OD值18022.56010.262.221.0029015.0607.421.830.5838030.0306.020.970.2148030.0906.111.020.2457015.0605.660.830.1467030.0605.710.780.1377022.5305.180.490.0088022.5609.662.080.9098015.0306.311.330.33109022.5306.711.590.44118022.5609.192.120.86129022.5907.301.690.54137022.5905.270.770.05148022.5609.472.180.91158015.0907.061.450.45168022.5609.022.010.81179030.0607.411.720.56采用Design-Expert 10.0.4软件对试验结果进行方差分析，方差分析结果见表3。进行多项式回归拟合，建立响应面回归模型：OD=0.90+0.22A-0.045B+0.038C-2.500×10-3AB+0.012AC-0.023BC-0.30A2-0.25B2-0.34C2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.017.T003表3方差分析结果项目平方和自由度均方F值P值显著性模型1.6890.1941.650.000 1**A0.4110.4190.230.000 1**B0.0210.023.610.099 2C0.0110.012.510.157 4AB2.50×10-512.50×10-55.57×10-30.942 6AC6.25×10-416.25×10-40.140.720 1BC2.03×10-312.03×10-30.450.523 3A20.3710.3782.610.000 1**B20.2610.2657.110.000 1**C20.4910.49109.560.000 1**残差0.0374.49×10-3失拟项0.0133.90×10-30.790.558 8纯误差0.0244.93×10-3总和1.7116R20.981 7R2Adj0.958 1注：*表示差异显著（P0.05）；**表示差异极显著（P0.01）。由表3可知，该回归方程的模型拟合相关系数R2=0.981 7，R2Adj=0.958 1，说明该模型可信度良好。该模型F值为41.65，且P0.000 1，模型差异极显著，方程与实际的拟合情况相符。失拟项P值0.558 8，无显著性，并且未知因素对试验结果有较小干扰，表明该响应曲面设计试验拟合回归方程具有显著意义，模型预测性较好。根据拟合回归方程各项方差数据可知，方程一次项系数A达到极显著水平，二次项系数A2、B2、C2均达到极显著水平，其他均无显著性。根据A、B、C三种单因素的F值90.23、3.61、2.51可知，单因素对OD值的影响程度为ABC。根据二次多项方程式，采用Design-Expert 10.0.4做出各因素相互作用对OD值影响的三维曲面图和二维等高线图，见图9~图11。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.017.F009图9提取温度和液料比对OD值的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.017.F010图10提取温度和乙醇浓度对OD值的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.017.F011图11液料比和乙醇浓度对OD值的影响由图9~图11可知，各因素之间交互作用对OD值影响均不明显，随着提取温度、料液比、乙醇浓度的增加，OD值逐渐增加，并出现极大值，随后呈现下降趋势。2.4最佳提取工艺确定及验证试验通过对拟合的线性回归方程进行层次的分析，软件分析给出最佳提取参数，即提取温度83.81 ℃、液料比21.78 mL/g、乙醇浓度61.97%。在此条件下，类叶升麻苷、木樨草苷得率的预测值分别为9.63、2.26 mg/g。结合实际试验，设置实际提取工艺参数为粒度目数100目、乙醇浓度62%、液料比22 mL/g、提取次数3次、提取时间1.5 h、提取温度83 ℃，进行提取工艺试验（n=3），实际测得类叶升麻苷与木樨草苷得率分别为9.62、2.25 mg/g，与理论预测值十分接近。2.5大青木提取物抗氧化活性比较2.5.1大青木提取物对DPPH·的清除率（见图12）由图12可知，随着大青木提取物浓度从5 mg/L升高到100 mg/L，对DPPH·的清除率逐渐增加。当大青木提取物浓度为100 mg/L时，对DPPH·清除率为65.80%。研究表明，大青木提取物对DPPH·有一定的清除作用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.017.F012图12大青木提取物对DPPH·的清除率2.5.2大青木提取物对ABTS·的清除率（见图13）由图13可知，随着大青木提取物浓度从5 mg/L升至100 mg/L，对ABTS·的清除率逐渐增加。当大青木提取物浓度为100 mg/L时，对ABTS·的清除率为65.36%。研究表明，大青木提取物对ABTS·有一定的清除作用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.017.F013图13大青木提取物ABTS·的清除率2.5.3大青木提取物对OH·的清除率（见图14）由图14可知，随着大青木提取物浓度从5 mg/L升高到100 mg/L，对OH·的清除率逐渐增加。当大青木提取物浓度为100 mg/L时，对OH·清除率为51.51%。研究表明，大青木提取物对羟自由基有一定的清除作用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.017.F014图14大青木提取物对OH·的清除率3结论本研究通过单因素试验及响应面优化后得到最佳提取工艺条件为：粒度目数100目、乙醇浓度62%、液料比22 mL/g、提取3次、每次提取1.5 h、提取温度83 ℃。采用此方法提取大青木中类叶升麻苷与木樨草苷的得率分别为9.62、2.25 mg/g，提取效率高。大青木提取物对DPPH自由基、ABTS自由基、羟自由基均表现出较好的清除能力。本研究仅对提取工艺进行优化，得到的样品为粗提物，未来应继续研究大青木提取物的纯化工艺，提高其类叶升麻苷及木樨草苷相对含量，为大青木抗奶牛乳房炎饲料添加剂的临床使用提供参考。