紫花苜蓿（Medicago sativa L.）为多年生豆类植物，每年可进行多次刈割。紫花苜蓿富含多种营养物质，叶片中的粗蛋白含量较高，作为粗饲料在畜牧业中被广泛应用。苜蓿对不同环境的适应性及耐旱性较强。由于固氮能力强，紫花苜蓿还具有提高土壤肥力的作用[1-3]。马兰花（Iris ensata var. chinensis），又称马蔺，具有产量高、可利用时间长、营养成分丰富的特点，可作为食草牲畜的饲料。马兰花具有调节免疫、抗肿瘤、抑菌等[4]功能。对牧草进行青贮可以在微生物的发酵作用下减少营养成分损失，提高适口性和消化率，从而改善动物的生产性能[5]。无水亚硫酸钠在饲料青贮过程中应用的报道较少[6]。本研究将马兰花与苜蓿按质量比7∶3进行混合青贮，添加无水亚硫酸钠，探究无水硫酸钠对青贮饲料的感官评定、营养成分、发酵品质以及蛋白分子结构的影响，旨在为苜蓿与马兰花混合青贮技术的应用推广提供参考。1材料与方法1.1试验材料第一茬的初花期金皇后紫花苜蓿和马兰花（含水量46%、49%）采自天津农学院试验田。无水亚硫酸钠（97%）购自河北科隆多生物科技有限公司。1.2试验设计将新鲜苜蓿和马兰花铡短至1~2 cm，新鲜马兰花与苜蓿质量比为7∶3。试验分为3组，每个处理设置3个重复。按照紫花苜蓿和马兰花原料质量分别添加0.4%、0.5%无水亚硫酸钠，分别为第1组和第2组。按照比例将无水亚硫酸钠配制成同体积溶液均匀喷洒在青贮原料上，对照组喷洒同体积纯水，分装至袋中，每袋500 g，混匀真空烫压封口，室温下贮存45 d。1.3测定指标及方法1.3.1感官评定按照德国农业协会评分法，根据青贮后饲料的气味、质地及色泽进行评分。通过得分进行评级，分为优良、尚好、中等和腐败4个等级[7]。1.3.2营养成分干物质（DM）、粗灰分（Ash）、粗脂肪（EE）、中性洗涤纤维（NDF）、酸性洗涤纤维（ADF）、钙（Ca）含量均参考张丽英[8]的方法测定；可溶性糖采用蒽酮硫酸指示剂法[9]测定。1.3.3发酵品质总氮（TN）采用凯氏定氮法[8]测定；pH值参考文献[10]的方法测定；氨态氮（NH3-N）采用纳氏试剂比色法[11]测定；乳酸（LA）采用对羟基联苯法[12]测定；挥发性酸包括乳乙酸（AA）、丙酸（PA）及丁酸（BA），采用气相色谱法[13]测定。1.3.4蛋白质二级结构测定图谱的采集与分子结构图谱分析参考田雨佳等[14]和谢孟峡等[15]的方法进行测定。1.4数据统计与分析数据采用Excel 2019软件进行处理，采用SPSS 23.0软件进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1无水亚硫酸钠对青贮饲料发酵品质的影响2.1.1无水亚硫酸钠对青贮饲料的感官评分的影响（见表1）由表1可知，对照组青贮饲料芳香味不足，有微弱酸味，颜色呈淡黄色，枝叶保存程度较低。处理组无酸味，有芳香味，色泽呈淡绿色，枝叶保存程度较好，感官评定得分高于对照组。处理组评定等级均为优。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.026.T001表1无水亚硫酸钠对青贮饲料的感官评分的影响组别气味色泽质地评分等级对照组72413尚好第1组111416优第2组112316优2.1.2无水亚硫酸钠对青贮饲料有机酸含量的影响（见表2）由表2可知，无水亚硫酸钠处理组青贮饲料LA含量均显著高于对照组（P0.05），第2组青贮饲料LA含量显著高于第1组（P0.05）；第1组青贮饲料AA含量显著低于对照组（P0.05）；无水亚硫酸钠处理组青贮饲料BA含量显著低于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.026.T002表2无水亚硫酸钠对青贮饲料有机酸含量的影响组别LAAAPABA对照组0.13±0.00c0.151±0.000a0.006±0.000a0.014 7±0.000 0a第1组0.21±0.01b0.040±0.001b0.006±0.000a0.001 3±0.000 0b第2组0.50±0.04a0.133±0.000a0.004±0.000b0.001 2±0.000 0b注：同列数据肩标无字母或相同字母表示差异不显著（P0.05），不同字母表示差异显著（P0.05）；下表同。%DM2.1.3无水亚硫酸钠对青贮饲料氮含量的影响（见表3）由表3可知，第1组青贮饲料TN含量显著低于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.026.T003表3无水亚硫酸钠对青贮饲料氮含量的影响组别TN/%DMNH3-N/%DMNH3-N/TN/%对照组1.95±0.10a0.057±0.0012.92±0.21第1组1.78±0.14b0.053±0.0002.97±0.21第2组1.85±0.19ab0.056±0.0033.03±0.302.1.4添加无水亚硫酸钠对青贮饲料pH值和可溶性糖含量的影响2.1.4.1无水亚硫酸钠对青贮饲料pH值的影响（见图1）由图1可知，第2组青贮饲料pH值显著低于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.026.F001图1无水亚硫酸钠对青贮饲料pH值的影响注：不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下图同。2.1.4.2无水亚硫酸钠对青贮饲料可溶性糖含量的影响（见图2）由图2可知，第1组青贮饲料可溶性糖含量显著高于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.026.F002图2无水亚硫酸钠对青贮饲料可溶性糖含量的影响2.2无水亚硫酸钠对青贮饲料营养成分的影响（见表4）由表4可知，经无水亚硫酸钠处理的青贮饲料的DM、EE含量显著高于对照组（P0.05）。其余各营养成分组间差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.026.T004表4无水亚硫酸钠对青贮饲料营养成分的影响组别DM/%Ash/%DMEE/%DMNDF/%DMADF/%DMCa/%DM对照组21.56±1.48b10.49±0.531.56±0.08b51.18±1.8737.76±0.631.01±0.09第1组26.35±0.54a11.72±0.253.03±0.20a48.17±2.4835.38±2.500.97±0.11第2组25.15±0.99a12.60±0.093.17±0.25a49.71±2.8137.13±2.311.00±0.072.3无水亚硫酸钠对青贮饲料蛋白质二级结构的影响2.3.1无水亚硫酸钠对青贮饲料蛋白二级结构的影响（见表5）由表5可知，无水亚硫酸钠处理组青贮饲料的酰胺Ⅰ带峰面积显著低于对照组（P0.05）。第1组青贮饲料的酰胺Ⅱ带峰高度以及酰胺Ⅱ带峰面积显著高于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.026.T005表5无水亚硫酸钠对青贮饲料的蛋白二级结构的影响组别酰胺Ⅰ带峰高度酰胺Ⅰ带峰基线范围酰胺Ⅰ带峰面积酰胺Ⅱ带峰高度酰胺Ⅱ带峰基线范围酰胺Ⅱ带峰面积对照组0.017±0.0001 712~1 5291.55±0.10a0.001 1±0.000 1a1 529~1 4830.01±0.00c第1组0.016±0.0001 702~1 5301.30±0.03b0.006 5±0.000 2b1 530~1 4990.04±0.01a第2组0.016±0.0001 707~1 5311.34±0.12b0.001 2±0.000 1a1 531~1 4830.03±0.01b2.3.2无水亚硫酸钠对青贮饲料蛋白质酰胺Ⅰ带和酰胺Ⅱ带的影响（见表6）由表6可知，无水亚硫酸钠处理组青贮饲料酰胺Ⅰ带和酰胺Ⅱ带的峰面积和显著低于对照组（P0.05）；无水亚硫酸钠处理组青贮饲料酰胺Ⅰ带和酰胺Ⅱ带的峰面积比显著低于对照组（P0.05）；第1组青贮饲料酰胺Ⅰ带和酰胺Ⅱ带的高度比显著低于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.026.T006表6无水亚硫酸钠对青贮饲料蛋白质酰胺Ⅰ带和酰胺Ⅱ带的影响组别酰胺Ⅰ带与Ⅱ带面积和酰胺Ⅰ带与Ⅱ带面积比酰胺Ⅰ带与Ⅱ带高度比对照组1.57±0.10a99.39±3.15a15.48±3.02a第1组1.33±0.04b35.89±2.45c9.29±1.03b第2组1.36±0.12b50.87±0.60b13.50±1.16ab2.3.3无水亚硫酸钠对青贮饲料蛋白质α-螺旋和β-折叠的影响（见表7）由表7可知，无水亚硫酸钠处理组青贮饲料的α-螺旋高度、β-折叠高度以及α与β高度比与对照组均无显著差异（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.026.T007表7无水亚硫酸钠对青贮饲料蛋白质α-螺旋和β-折叠的影响组别α-螺旋高度α-螺旋中心β-折叠高度β-折叠中心α与β高度比对照组0.09±0.051 6220.03±0.011 5951.93±0.41第1组0.10±0.041 6200.05±0.011 5951.97±0.56第2组0.05±0.011 6240.03±0.011 5981.62±0.083讨论3.1无水亚硫酸钠对青贮饲料发酵品质的影响品质较好的青贮饲料的颜色应该与植物原有颜色相差不大，具有一定的酸香味或是果香味。青贮饲料有明显的臭味、鱼腥味，表明青贮饲料中存在较多的丁酸或是较多蛋白质分解。同时，青贮原料的结构应保持完好，不能存在霉变。本试验在马兰花和苜蓿青贮饲料中添加无水亚硫酸钠，按照DLG的评分标准，对青贮品质进行感官评定总体评分表明，各组的感官评定均良好，而对照组感官品质得分最低。LA可以控制青贮饲料的质量，因为LA是最有效的发酵酸，可使青贮饲料的pH值快速下降[7]。BA含量可以用来判断青贮饲料品质。BA含量越低，品质越好[16]。本试验添加无水亚硫酸钠，LA含量均得到显著提高，AA、BA含量降低，虽然在处理组中检测到BA的存在，但是其含量几乎可以忽略不计。原因可能是添加无水亚硫酸钠促进了乳酸菌的发酵，从而产生更多的LA。青贮饲料pH值是影响发酵程度和青贮饲料质量的主要因素之一[17]。本试验中，添加无水亚硫酸钠的处理组pH值低于对照组，可能是LA含量较高可以促使pH值降低，青贮饲料得以长期保存，与前文中LA含量增多的结果一致。3.2无水亚硫酸钠对青贮饲料营养成分的影响NDF和ADF是判断纤维品质的最直观的指标[18]。酸性洗涤纤维可以很好地反映饲料能量水平，与动物消化率呈负相关。青贮饲料中ADF含量越低，家畜对饲料的消化率也就越高[19]。本试验结果表明，在马兰花和苜蓿青贮中添加无水亚硫酸钠组青贮饲料的EE含量显著高于对照组；NDF和ADF含量均有一定程度的下降，可以在不同程度上增加干物质含量。因此，在马兰花和苜蓿青贮中添加无水亚硫酸钠可以提高青贮饲料的营养品质。3.3无水亚硫酸钠对青贮饲料蛋白质二级结构的影响蛋白质作为一种重要营养成分，在细胞内含量最多，也是最主要的功能分子。但是，蛋白质含量相近并不意味蛋白质的内部分子结构相似，蛋白质的二级结构对其功能尤为重要[20]。Yu[21]研究发现，蛋白质的降解特性、利用率和有效性取决于蛋白质的类型，并且与蛋白质内在结构（例如蛋白质二级结构：α-螺旋、β-折叠及两者比例）高度相关。β-折叠比例过高可能导致胃肠道消化酶的利用率降低，从而降低蛋白利用率。本试验中，各组蛋白质一峰中心基本在1 700~1 600 cm-1范围内，蛋白质二峰中心基本在1 600~1 500 cm-1范围内。添加无水亚硫酸钠可以在一定程度上改变酰胺Ⅰ区和酰胺Ⅱ区的峰高度及峰面积，酰胺Ⅰ区和酰胺Ⅱ区面积和以及面积比，但各组之间作用并不一致。齐宝坤等[22]对绿豆蛋白二级结构的研究表明，α-螺旋含量降低，β-折叠含量增加对于蛋白分子柔韧性存在正向作用，使得蛋白质功能特性得到提高。但是，本研究中，各组之间α-螺旋高度和β-折叠高度比值无显著差异。蛋白质分子的二级结构特性可能影响其在反刍动物瘤胃内的代谢特性[23]。本试验中，添加无水亚硫酸钠能够影响青贮饲料的营养特性和发酵品质，同时影响蛋白质的二级结构，从而影响其在动物体内的利用率，具体作用机理仍需进一步研究。4结论在苜蓿马兰花混合青贮中添加适量的无水亚硫酸钠可以提高感官品质、营养品质以及发酵品质，对蛋白质二级结构有一定影响，但其变化规律及作用机理有待进一步研究。本试验中，0.5%无水亚硫酸钠为最适添加量。