枇杷叶性微寒，味苦辛，具有清肺、止呕、止咳等作用[1]。枇杷在我国的江苏、福建、浙江、四川、云南、广西等地均有分布[2]。枇杷叶中含有三萜类、酚酸类、黄酮类、皂苷类、挥发油、倍半萜类等活性成分[3]。黄酮类化合物具有抗氧化活性、抗病毒、抗炎症及保护心脑血管等多种功效[4-5]。在动物饲料中添加中草药可以增加饲料的营养价值，提高饲料的药用价值[6]。王咏梅等[7]研究发现，在凡纳滨对虾养殖饵料料中添加桑叶黄酮，可以改善对虾肠道微生物多样性，促进对虾的肠道发育。江阳等[8]研究发现，在肉仔鸡养日粮中添加艾蒿黄酮，可以提高肉鸡的生长性能，改善肉品质。刘瑞雪等[9]研究发现，黄酮类化合物作为饲料添加剂可以提高动物的免疫力。传统提取枇杷叶黄酮的方法主要有酶辅助提取[10]、微波提取[11]、减压内部沸腾提取[12]等方法，但采用超声波辅助双水相提取法较为少见。双水相提取法[13]是利用组分在两个互不相容的两相中的溶解性不同而达到分离的技术，具有操作简便、溶剂用量少、提取效率较高、容易处理等优点。超声波在提取液不断振荡，产生“空化作用”从而破坏植物细胞结构，增强溶质在细胞膜的透过率，有利于黄酮类物质的释放与溶出，并且促进溶质扩散[14]，具有省时、省力、高效、杂质少的优点[15]。结合双水相和超声波辅助提取的优点。本试验采用超声波辅助乙醇-硫酸铵双水相体系提取枇杷叶中的黄酮，为枇杷叶黄酮的进一步开发和利用提供参考。1材料与方法1.1试验材料枇杷叶粉产地为广西，枇杷叶主要有效成分含量见表1[16]。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.015.T001表1枇杷叶主要有效成分含量项目含量总黄酮48.70多糖19.53三萜酸7.86mg/g1.2试验试剂芦丁标准品（HPLC≥95%），购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；硫酸铵、氢氧化钠、硝酸铝、乙醇、水杨酸、硫酸亚铁、30%过氧化氢、亚硝酸钠均为分析纯，购自西陇科学股份有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）纯度≥98%，购自合肥巴斯夫生物科技有限公司。1.3仪器设备722s型可见分光光度计购自上海仪电分析仪器有限公司；KQ-300DB型数控超声波清洗器购自昆山市超声仪器有限公司；8H2-D111型循环水式多用真空泵购自巩义市科瑞仪器有限公司；DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器购自巩义市予华仪器有限责任公司；HH-S4型数显恒温水浴锅购自金坛区医疗仪器厂。1.4试验方法1.4.1芦丁标准曲线的绘制参照陈利梅[17]的方法稍做修改。准确称取0.02 g芦丁标准品于100 mL容量瓶中，使用30%乙醇溶解定容，得到的芦丁标准液的质量浓度为0.20 g/L。分别向相对应容量瓶中加入1、2、3、4、5、6 mL芦丁标准液，加入1.0 mL 5%亚硝酸钠溶液，摇匀，静置6 min。加入1.0 mL 10%硝酸铝溶液，摇匀，静置6 min，加入6 mL 4%的氢氧化钠溶液，摇匀，使用体积分数为30%的乙醇定容至刻度线，静置15 min，以30%乙醇做参比，于波长510 nm测其吸光度值[18]。以芦丁标准样品液浓度为横坐标x,吸光度值为纵坐标y绘制标准曲线，得到的回归方程为：y=10.621x＋0.002 6，R2=0.999 8。1.4.2黄酮含量的测定准确称取枇杷叶粉末1 g加入乙醇-硫酸铵双水相体系中，在超声功率270 W、超声温度40 ℃于超声波清洗器中提取40 min，对双水相体系进行减压抽滤，收集提取液于分液漏斗中进行静置分层，弃去下层液体，收集上层清液于容量瓶中，根据芦丁标准曲线绘制方法测定枇杷叶粉末提取液中的黄酮浓度，计算超声波辅助双水相提取枇杷叶黄酮的提取量[19]。黄酮提取量(mg/g)＝Ｃ×Ｖ×Ｎ/Ｍ (1)式中：Ｃ为供试品溶液黄酮浓度（g/L）；Ｖ为上清液体积（mL）；Ｎ为稀释倍数；Ｍ为称取枇杷叶粉末的质量（g）。1.4.3单因素试验在固定超声功率270 W、液料比30 mL/g、乙醇溶液浓度40%、硫酸铵9 g、超声30 min的基础上，进行单因素试验，研究超声温度（20、30、40、50、60 ℃）、超声时间（10、20、30、40、50 min）、液料比（10、20、30、40、50 mL/g）、硫酸铵用量（7、8、9、10、11 g）、乙醇浓度（30%、35%、40%、45%、50%）对枇杷叶黄酮提取量的影响。每个试验重复3次。1.4.4正交试验设计为了确定较佳提取条件，在单因素试验的基础上，以枇杷叶黄酮提取量为评价指标，参照文献[20]的方法，设计L9（34）正交试验。鉴于乙醇-硫酸铵双水相体系的相对稳定性，固定乙醇浓度35%，考察超声时间、超声温度、硫酸铵用量、液料比4个因素对枇杷叶黄酮提取量的影响。L9（34）正交试验因素水平设计见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.015.T002表2L9（34）正交试验因素水平设计因素水平A超声温度/℃B超声时间/minC液料比/(mL/g)D硫酸铵用量/g1302020724030308350404091.4.5抗氧化试验1.4.5.1羟自由基（OH·）清除试验将最优工艺条件下提取到的枇杷叶黄酮提取液进行浓缩，使用乙醇将浓缩液稀释梯度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L待测液，同样使用乙醇配制维生素C为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L的待测液。根据廖圆圆等[21]方法稍做修改测定枇杷叶黄酮对羟自由基的清除效果，并与维生素C对比。按照试验顺序向10 mL容量瓶中依次加入6 mmol/L的硫酸亚铁2 mL，6 mmol/L的水杨酸2 mL及不同浓度的枇杷叶黄酮样品溶液2 mL，混匀，6 mmol/L过氧化氢2 mL，摇匀，37 ℃恒温水浴反应15 min，在可见分光光度计510 nm条件下测量各样品液浓度的吸光度记为Ai值。以不加黄酮吸光度为A0，未添加过氧化氢吸光度为Aj。在相同条件下测定维生素C溶液（设置5个样品液浓度梯度）对羟自由基（OH·）的清除效果，计算羟自由基（OH·）清除率。OH·清除率=[A0-(Ai-Aj)]/A0×100%(2)1.4.5.2DPPH自由基（DPPH·）清除试验枇杷叶黄酮待测液和维生素C待测液的配制方法与“1.4.5.1”相同。采用吴春霞等[22]方法测定枇杷叶黄酮对DPPH·的清除效果，并与维生素C做比较。于10 mL容量瓶中依次加入0.2 mmol/L DPPH·溶液2.0 mL，无水乙醇2.0 mL，摇匀，室温避光静置反应30 min，在517 nm处测吸光度值，记为A0；10 mL容量瓶加入0.2 mmol/L DPPH·溶液2.0 mL和枇杷叶黄酮提取液2.0 mL，摇匀，室温避光静置反应30 min，在517 nm处测吸光度值，记为Ai；10 mL容量瓶加入枇杷叶黄酮提取液2.0 mL和无水乙醇2.0 mL，记为Aj。测定吸光度值时，使用无水乙醇作参比。在相同条件下测定维生素C溶液对DPPH·的清除效果，计算枇杷叶黄酮对DPPH·自由基的清除能力。DPPH·清除率=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%(3)1.5数据统计与分析采用正交试验设计软件和Origin 9.0对数据进行统计分析。2结果与分析2.1单因素试验2.1.1超声温度对枇杷叶黄酮提取量的影响（见图1）由图1可知，超声温度范围在20~40 ℃，枇杷叶黄酮提取量逐渐上升；当超声温度达到40 ℃，黄酮提取量达到峰值；温度继续升高，黄酮提取量缓慢下降。原因可能是超声温度过低时黄酮溶解缓慢；温度升高促进溶剂的渗透，加快分子热运动的速度[23]，增大溶剂分子和黄酮分子的接触概率，有利于黄酮溶出，使枇杷叶黄酮提取量得到进一步增加。由于超声温度升高，促使枇杷叶中一些杂质成分更加容易溶出，与黄酮形成激烈竞争，破坏黄酮类物质的稳定性和组织结构，导致部分黄酮发生氧化、分解，最终使枇杷叶黄酮的提取量降低。因此，确定40 ℃为提取枇杷叶黄酮的最佳温度。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.015.F001图1超声温度对枇杷叶黄酮提取量的影响2.1.2超声时间对枇杷叶黄酮提取量的影响（见图2）由图2可知，枇杷叶黄酮提取量随着时间的增加，先上升再下降。在超声时间为10~30 min时，黄酮提取量呈上升趋势；在30 min时，枇杷叶黄酮提取量达到最大值；延长提取时间，黄酮提取量下降。原因可能是在超声时间为10~30 min，超声的机械效应和空化作用使溶剂的穿透能力得到增强，有利于黄酮的溶出；时间过长，超声波的机械作用或温热效应导致部分黄酮分解或氧化[24]，导致黄酮提取量减少。因此，确定30 min为提取枇杷叶黄酮的最佳时间。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.015.F002图2超声时间对枇杷叶黄酮提取量的影响2.1.3液料比对枇杷叶黄酮提取量的影响（见图3）由图3可知，随着液料比的升高，枇杷叶黄酮提取量先增后减。原因可能是枇杷叶细胞内的黄酮类化合物主要由酯键、苷键等疏水键和多糖、蛋白质等结合，溶剂进入细胞内导致疏水键被破坏，黄酮浸出[25]。当液料比过小时，溶剂渗透并扩散到枇杷叶细胞内的速度和黄酮化合物扩散到溶剂中的速度小；液料比过大，对溶剂进入细胞内破坏疏水键和黄酮化合物扩散至溶剂中有利，但溶剂用量过多时，会造成硫酸铵和溶剂用量增大，影响乙醇-硫酸铵双水相的稳定性，从而导致黄酮提取量减少。液料比太小或者太大都对枇杷叶黄酮的提取不利。液料比30 mL/g时，黄酮提取量最高，为10.47 mg/g。因此，液料比30 mL/g为提取枇杷叶黄酮的最佳液料比。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.015.F003图3液料比对枇杷叶黄酮提取量的影响2.1.4硫酸铵用量对枇杷叶黄酮提取量的影响（见图4）由图4可知，随着硫酸铵用量的增大，黄酮提取量先增后减。原因可能是乙醇-硫酸铵体系提取是双液相提取，硫酸铵会和乙醇相互争夺水分子，体系中的醇水相比以及分配系数受到影响[26]。但硫酸铵的用量增大，使双水相体系的乙醇相浓度增大。因此，有利于黄酮的萃取。在硫酸铵用量为8 ｇ时，双水相体系（上层为乙醇，下层为硫酸铵）上下分层清晰。但硫酸铵用量过多，乙醇-硫酸铵体系的稳定性受到影响，大量的硫酸铵晶体析出，影响黄酮的溢出，导致黄酮提取量下降。硫酸铵用量8 g时，黄酮提取量最高，为10.81 mg/g。因此，8 g硫酸铵为提取枇杷叶黄酮的最佳用量。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.015.F004图4硫酸铵用量对枇杷叶黄酮提取量的影响2.1.5乙醇浓度对枇杷叶黄酮提取量的影响（见图5）由图5可知，随着乙醇浓度的增大，黄酮提取量先升后降。可能是加入过低的乙醇浓度，不利于黄酮的溶解，导致黄酮提取量小；增大乙醇浓度，增加了双水相体系的分相能力，处于上层的乙醇体积增加[27]，有利于脂溶性黄酮的溶解，从而枇杷叶黄酮提取量增加；但过高的乙醇浓度，促使部分脂溶性杂质与黄酮相互竞争溶剂，抑制了黄酮分子从枇杷叶粉末中溢出，最终导致黄酮提取量降低。乙醇浓度为35%时，黄酮提取量最高，为10.02 mg/g。因此，35%乙醇浓度为提取枇杷叶黄酮的最佳浓度。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.015.F005图5乙醇浓度对枇杷叶黄酮提取量的影响2.2枇杷叶黄酮超声波辅助双水相提取工艺优化结果2.2.1试验结果及分析L9（34）正交试验结果见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.015.T003表3L9（34）正交试验结果项目ABCD黄酮提取量/(mg/g)111118.992122210.03313339.98421239.83522319.596231210.11731329.80832139.339332110.20k19.679.549.489.59k29.849.6510.029.98k39.7810.109.799.71R0.170.560.540.39由表3可知，枇杷叶黄酮的较优提取工艺为：A2B3C2D2，即超声温度40 ℃、提取时间40 min、液料比30 mL/g、硫酸铵用量8 g。各因素对枇杷叶黄酮提取效果的影响主次顺序为：B＞C＞D＞A，即超声时间＞液料比＞硫酸铵用量＞超声温度。2.2.2工艺验证为了进一步验证提取工艺的可靠性及稳定性，依据枇杷叶黄酮提取较优工艺组合A2B3C2D2，进行3次平行试验，平均提取量为10.82 mg/g。对正交试验表中的最大枇杷叶黄酮提取量的工艺A3B3C2D1，进行3次平行试验的平均提取量为10.22 mg/g。因此，正交试验得出的最佳黄酮提取工艺条件可行且稳定。最佳工艺条件为超声温度40 ℃、超声时间40 min、液料比30 mL/g、硫酸铵用量8 g、乙醇浓度35%、超声功率270 W。2.3枇杷叶黄酮的抗氧化活性结果2.3.1不同浓度枇杷叶黄酮对羟自由基清除率的影响（见图6）由图6可知，枇杷叶黄酮对OH·有较强的清除能力，但清除能力略低于VC。在质量浓度为0.1~0.5 g/L时，枇杷叶黄酮对羟自由基的清除率呈上升趋势。在浓度为0.5 g/L时，枇杷叶黄酮对OH·的清除率达到59.89%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.015.F006图6不同浓度枇杷叶黄酮对OH·的清除能力2.3.2不同浓度枇杷叶黄酮对DPPH自由基的清除率的影响（见图7）由图7可知，在质量浓度为0.1~0.5 g/L时，枇杷叶黄酮对DPPH·的清除率整体呈上升趋势。枇杷叶黄酮质量浓度为0.5 g/L时，对DPPH·的清除率达到98.58%，此时枇杷叶黄酮对DPPH·的清除能力高于VC。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.015.F007图7不同浓度枇杷叶黄酮对DPPH·的清除能力3结论超声波辅助双水相提取枇杷叶黄酮的较优提取工艺为超声功率270 W、乙醇浓度35%、超声温度40 ℃、时间40 min、液料比30 mL/g、硫酸铵用量8 g。在此工艺条件下，得出枇杷叶黄酮提取量为10.82 mg/g。在一定浓度范围内，枇杷叶黄酮清除自由基的能力随着质量浓度的增加而增强，并且清除OH·和DPPH·的能力和浓度存在量效关系。